【摘要】：冠心病已成為高發(fā)病率和死亡率的主要疾病之一,其主要致死原因?yàn)榧毙孕募」Ｋ�。隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、溶栓、血管形成術(shù)和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)等急性心肌梗死治療方法的發(fā)展,由心肌缺血再灌注引起的心肌收縮功能障礙、心肌頓抑、心律失常以及不可逆的心肌細(xì)胞損害使缺血再灌注損傷成為了臨床研究的重要問(wèn)題。多項(xiàng)研究表明,進(jìn)行缺血再灌注同時(shí)或再灌注以前,使用藥物和心肌保護(hù)劑能減輕心肌缺血再灌注損傷,減少心肌梗死面積,對(duì)防止心肌缺血再灌注損傷具有重要意義。但目前仍缺乏能夠有效治療心肌缺血再灌注損傷的策略及藥物。如何減輕缺血再灌注損傷,提高急性心肌梗死患者的術(shù)后生存率仍然是治療急性心肌梗死急需解決的難題。雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide,TPL)是從雷公藤的根中提取的二萜內(nèi)酯,具有抗炎、抗氧化、抗癌等多種功效,其抗炎作可以促進(jìn)糖尿病性心肌病大鼠心室功能恢復(fù),緩解心肌纖維化,對(duì)心臟具有保護(hù)作用。此外,TPL對(duì)缺血再灌注引起的器官或組織損傷也具有保護(hù)作用,TPL能夠有效抑制氧化應(yīng)激和炎性因子表達(dá),降低中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),緩解肝臟、肺等器官的缺血再灌注損傷。由于氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān),TPL在預(yù)防與治療氧自由基和炎癥反應(yīng)引起的心肌缺血再灌注損傷中是否具有保護(hù)作用,目前尚不清楚。因此本研究通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,腹腔注射TPL溶液后,探究TPL對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其作用機(jī)理,為缺血再灌注損傷的臨床治療奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目的:1、建立大鼠心肌缺血再灌注模型,觀察TPL是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。2、探究TPL對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心臟組織炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制。3、探究TPL對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心臟組織氧化應(yīng)激的影響及其機(jī)制。方法:1、TPL對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(1)建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型,雄性健康Wistar大鼠隨機(jī)分為六組:(1)假手術(shù)組,(2)假手術(shù)與高劑量TPL組(sham+H-TPL group),(3)缺血再灌注損傷模型組(I/R group),(4)I/R與低劑量TPL組(I/R+L-TPL group),(5)I/R與中劑量TPL組(I/R+M-TPL group),(6)I/R與高劑量TPL組(I/R+H-TPL group)。(2)腹腔注射不同劑量(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)TPL溶液,用飛利浦IE33超聲系統(tǒng)進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集,包括左心室收縮末期壓(LVESP),左心室舒張末期壓(LVEDP)及心臟縮短分?jǐn)?shù)(FS)。(3)抽取各組大鼠血液樣本,用試劑盒檢測(cè)血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性。(4)HE染色檢測(cè)各組大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)變化。(5)免疫組化檢測(cè)各組大鼠心臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況。(6)TTC法檢測(cè)各組大鼠的心肌梗死面積。2、TPL對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心臟組織炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制(1)建立大鼠心肌缺血再灌注模型,腹腔注射不同劑量(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)TPL溶液,Real-time PCR檢測(cè)大鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的m RNA表達(dá)情況。(2)ELISA檢測(cè)大鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。(3)Western blot檢測(cè)大鼠心臟組織中P38 MAPK、p-P38 MAPK的表達(dá)。3、TPL對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心臟組織氧化應(yīng)激的影響及其機(jī)制(1)建立大鼠心肌缺血再灌注模型,腹腔注射不同劑量(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)TPL溶液,測(cè)定大鼠心臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、血紅素加氧酶1(HO-1)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)的活性以及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。(2)Western blot檢測(cè)大鼠心臟組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,觀察指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示兩組間比較采用t檢驗(yàn),p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采集結(jié)果顯示,高劑量TPL明顯降低I/R大鼠LVEDP,增加LVESP和FS(與I/R模型組大鼠比較,p0.05)。2、血清中酶活檢測(cè)結(jié)果表明,與I/R模型組相比,預(yù)先腹腔注射高劑量TPL(100μg/kg)能明顯降低I/R大鼠血清CK、LDH及GOT活性(p0.01)。3、HE染色顯示,高劑量TPL(100μg/kg)I/R大鼠心肌細(xì)胞只有少量壞死區(qū)域,心肌纖維排列較整齊,心肌細(xì)胞間質(zhì)僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),結(jié)構(gòu)清晰,能夠顯著改善心臟組織I/R損傷的病理學(xué)改變。4、免疫組化結(jié)果表明,TPL能夠減少心臟組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量。5、TTC法檢測(cè)各組大鼠的心肌梗死面積發(fā)現(xiàn),預(yù)先腹腔注高劑量TPL(100μg/kg)能明顯降低I/R大鼠心肌梗死面積(與I/R模型組大鼠比較,p0.01)。6、Real-time PCR結(jié)果顯示,與I/R組相比,中、高劑量TPL能顯著降低TNF-αm RNA的表達(dá)(p0.01)不同劑量TPL均能顯著降低IL-1β和IL-6 m RNA的表達(dá)(p0.01)。7、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,預(yù)先腹腔注射低、中、高劑量TPL均能顯著降低I/R大鼠心臟組織TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)(與I/R模型組大鼠比較,p0.05,p0.01)。8、Western blot檢測(cè)TPL對(duì)I/R大鼠心臟組織中P38、p-P38的表達(dá)影響,結(jié)果顯示,不同劑量TPL均能明顯提高p-P38蛋白表達(dá)量(與I/R模型組比較,p0.01)。9、腹腔注射中劑量TPL(50μg/kg)能夠提高I/R大鼠心臟組織SOD、HO-1和GSH-PX活性(與I/R模型組大鼠比較,p0.05,p0.01),但心臟組織中MDA、GSH含量沒(méi)有顯著改變。與I/R模型組大鼠比較,高劑量TPL(100μg/kg)I/R大鼠心臟組織中SOD、HO-1、GSH-PX活性均明顯升高(p0.01),MDA產(chǎn)物明顯減少(p0.01),GSH含量明顯增多0(p0.01)。10、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,預(yù)先腹腔注射低、中、高劑量TPL(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)I/R大鼠心臟組織細(xì)胞核Nrf2表達(dá)量明顯上調(diào)(與I/R組相比,p0.01)。結(jié)論:1、高劑量TPL(100μg/kg)可以改善大鼠缺血再灌注后心臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂,增強(qiáng)心肌收縮力,促進(jìn)心臟功能恢復(fù)。2、高劑量TPL能明顯降低I/R大鼠血清CK、LDH及GOT活性,減輕心肌損傷,顯著改善心臟組織I/R損傷的病理學(xué)改變,降低心臟組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量,明顯減少I/R大鼠心肌梗死面積。3、TPL(25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg)可明顯抑制I/R大鼠心臟組織TNF-α、IL-1β、IL-6 m RNA和蛋白的表達(dá),有效降低心肌缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng),TPL對(duì)P38 MAPK信號(hào)通路的激活與抗心肌缺血再灌注的炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。4、高劑量TPL(100μg/kg)可增強(qiáng)I/R大鼠抗氧化能力,明顯提高I/R大鼠心臟組織SOD、HO-1、GSH-PX活性,增加GSH含量,降低MDA含量。5、TPL能夠激活I(lǐng)/R大鼠心臟組織Nrf2抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路,且TPL可能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗心肌缺血再灌注氧化損傷。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

PL 對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟組織病理改變的影響組大鼠經(jīng)缺血 45 min，再灌注 3 h 后，將各組大鼠心臟組織常規(guī)脫圖 2，結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)無(wú)改變，結(jié)構(gòu)清晰，整齊，呈紅色，細(xì)胞核為長(zhǎng)橢圓形，呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞間質(zhì)無(wú)炎性劑量 TPL 假手術(shù)組染色結(jié)果與假手術(shù)組相似。I/R 組心肌纖維排列部橫紋不清，心肌纖維間隙增寬，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及出血現(xiàn)大量心肌細(xì)胞壞死區(qū)域，呈粉白色。 I/R 組相比，TPL 低劑量 I/R 大鼠心肌細(xì)胞壞死區(qū)域減少，組織出血潤(rùn)減少，但大部分心肌纖維排列紊亂。TPL 中劑量 I/R 大鼠心肌細(xì)著減少，心肌纖維排列局部出現(xiàn)紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少顯著減少， I/R 大鼠心肌細(xì)胞只有少量壞死區(qū)域，心肌纖維排列較整齊，心肌少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)清晰。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文、TPL 對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響各組實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)缺血 45 min，再灌注 3 h 后，用 F4/80 抗體進(jìn)行免疫組化組大鼠心臟組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，結(jié)果如圖 3，心臟組織中巨噬細(xì)胞色。假手術(shù)組與高劑量 TPL 假手術(shù)組大鼠心臟組織中可見(jiàn)少數(shù)巨噬細(xì)胞，而型組大鼠心臟組織中可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。與 I/R 模型組相比，預(yù)先腹腔注射低劑量 TPL 的 I/R 大鼠心臟組織中巨數(shù)量有所減少，而中劑量 TPL 的 I/R 大鼠心臟組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減劑量 TPL 的 I/R 大鼠心臟組織中僅有少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2727751