【摘要】：仙人掌是熱帶與亞熱帶地區(qū)分布極廣的野生植物資源,但利用率極低。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)明確仙人掌多糖(Opuntia dillenii Haw.polysaccharides,ODPs)具有調(diào)節(jié)血脂和抗動脈粥樣硬化作用,但具體機(jī)制尚未明確。本研究的主要目的是優(yōu)化ODPs提取方法、篩選高活性組分ODP-Ia并明確其結(jié)構(gòu)、闡明ODP-Ia抗動脈粥樣硬化的具體分子機(jī)制,以促進(jìn)仙人掌的利用。主要研究結(jié)果如下:1.通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到ODPs最佳提取工藝為提取溫度93℃,液料比62:1,提取時間3.5 h,由模型預(yù)測ODPs得率達(dá)到25.14%,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為25.05%,與預(yù)測值較接近。提取溫度為95℃時,多糖含量、DPPH自由基清除率都最高,但多糖中蛋白質(zhì)含量也最高。隨著仙人掌干粉粉碎程度增加,ODPs得率、純度及對和·OH的清除作用顯著增加,300目碎度與粗粉比較,多糖得率、含量及對清除作用分別提高了100%、25%和150%。以上結(jié)果說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝有利于提高ODPs得率,95℃的提取溫度有利于增加多糖的抗氧化活性。粉碎技術(shù)有助于提高仙人掌多糖的釋放量并保持其品質(zhì)及功效活性。2.采用陰離子交換樹脂DEAE Sepharose Fast Flow和丙烯葡聚糖凝膠Sephacryl S-400分離純化ODPs獲得四個組分ODP-Ia、ODP-Ib、ODP-IIa和ODP-IIb。ODP-Ia、ODP-Ib經(jīng)紫外光譜掃描證實(shí)不含蛋白質(zhì)和核酸,經(jīng)Sephacryl S-400凝膠柱層析后證實(shí)為純品。凝膠過濾法測定ODP-Ia和ODP-IIa分子量分別為339 kD和943 kD。紅外光譜分析確定ODPs是α-吡喃多糖、ODP-Ia是β-吡喃多糖,ODP-IIa是β-甘露多糖。ODP-Ia對·OH、DPPH·、清除作用最強(qiáng),其次是ODP-IIa和ODPs。3.成功構(gòu)建了THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型,ODP-Ia可以顯著抑制THP-1巨噬細(xì)胞的泡沫化,減少脂質(zhì)蓄積,同時顯著促進(jìn)泡沫細(xì)胞中膽固醇流出,且存在劑量關(guān)系。高劑量組15 nmol/L ODP-Ia產(chǎn)生的作用接近于陽性對照依折麥布組。提示ODP-Ia可以通過促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)中限速步驟——膽固醇流出以達(dá)到促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。4.明確了20 mg/mL apoA-I處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h后,胞內(nèi)膽固醇流出量顯著增加,在該條件下,若同時加入ODP-Ia處理,apoA-I介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出量更大,且存在劑量關(guān)系。5.ODP-Ia能顯著上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中PPARγ、PPARα、LXRα、ABCA1、ABCG1、SR-BI mRNA及蛋白的表達(dá),提示ODP-Ia通過上調(diào)這些基因的表達(dá)來發(fā)揮促進(jìn)膽固醇流出的作用。6.加入LXRα拮抗劑GGPP或PPARγ拮抗劑GW9662后,ODP-Ia對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出的促進(jìn)作用以及對ABCA1和ABCG1表達(dá)的上調(diào)作用都顯著被抑制。PPARγ拮抗劑GW9662都能同時下調(diào)或抑制PPARγ和LXRαmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。提示PPARγ和LXRα兩種核受體存在級聯(lián)作用,PPARγ-LXRα通路在ODP-Ia促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出過程中發(fā)揮調(diào)控作用。以上研究結(jié)果完善了ODPs提取條件優(yōu)化的系統(tǒng)性,為制定ODPs的提取規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù),并為闡明ODPs降膽固醇作用機(jī)制提供新的思路,有利于促進(jìn)其開發(fā)利用。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 G5（ABCG5）、膽固醇 7α 羥化酶表達(dá)；祝驥等（2現(xiàn)川穹嗪能降低泡沫細(xì)胞內(nèi)總膽固醇和膽固醇酯，抑制脂質(zhì)積累，異黃酮則通過誘導(dǎo) ABCA1 mRNA 和蛋白表達(dá)，促進(jìn)動脈硬化小鼠體膽固醇外排，促進(jìn) RCT，進(jìn)行改善脂質(zhì)代謝（李培兵等，2014）。這，在眾多具有調(diào)節(jié)膽固醇的功能性物質(zhì)中，RCT 是普遍存在的機(jī)制之徑相關(guān)的調(diào)節(jié)因子 RCT 過程包括膽固醇的流出、酯化、轉(zhuǎn)運(yùn)、攝取和排泄，但普遍認(rèn)為胞中流出是關(guān)鍵限速步驟。因此，對膽固醇流出環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控的相關(guān)關(guān)重要。介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇流出的三條主要途徑中的相關(guān)因子包括合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子 A1（ABCA1），它與游離載脂蛋白 apoAI 或前 β-HDL 結(jié)合合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子 G1(ABCG1)與比較成熟的 HDL 結(jié)合；清道夫受體 B 族receptor class B type， SR-BⅠ)與成熟的 HDL 結(jié)合，他們對巨噬細(xì)胞膽起著關(guān)鍵作用（Remaley et al., 2011）。

結(jié)果差異不大，當(dāng)溫度上升至 100℃水平時，多糖含量出現(xiàn)了小幅度的下降。所以，選擇 80、90、100℃三個水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。圖2-1 提取溫度對ODPs多糖含量的影響Figure 2-1 Effect of temperature on the polysaccharides content of crude extracts一般認(rèn)為，提取溫度上升更有利于植物細(xì)胞的破碎，使細(xì)胞內(nèi)的多糖溶出量增加。

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1 李恒;仙人掌多糖ODP-Ia初步結(jié)構(gòu)及其促進(jìn)泡沫細(xì)胞膽固醇外流作用研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

本文編號：2727298