【摘要】：胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,死亡率位居全球第2位。在中國,2015年胃癌的發(fā)病率為15.8%,死亡率為17.6%,在癌癥發(fā)病順位中排第二。早期胃癌患者預(yù)后較好,且根治性手術(shù)治療療效顯著,其術(shù)后5年生存率在85-90%之間[21,但胃癌早期檢出率較低,中國胃癌患者中超過75%確診時已進(jìn)展至中晚期階段。目前臨床上胃癌的治療方法不多,單純手術(shù)治療患者的總體生存率僅19%左右,療效不佳。此外,放、化療雖為治療惡性腫瘤的一個重要手段,但其副作用較大,多應(yīng)用于術(shù)前或術(shù)后的輔助性治療或姑息性治療。早期侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因,同時腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機制十分復(fù)雜。這一過程主要包括細(xì)胞粘附分子(CAM)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的變化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤血管生成等,并受多種多樣的因素調(diào)控。研究表明,抗增殖蛋白(Prohibitin,PHB)是一種進(jìn)化上高度保守的蛋白,在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝、增殖凋亡、核轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮了重要功能。在多種惡性腫瘤中存在PHB的異常表達(dá),有研究發(fā)現(xiàn)PHB與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物,又名過山風(fēng)、黃藤等,其藤莖、根、葉、果實、種子均可入藥,有祛風(fēng)除濕、行氣活血、消腫止痛、解毒等功效。南蛇藤乙酸乙醋提取物(Celastrus Orbiculatus ethylacetate extract,COE)抗腫瘤活性較強。近年體內(nèi)、外相關(guān)實驗研究發(fā)現(xiàn),COE能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡自噬、抑制血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力等,進(jìn)而抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),COE能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和EMT的發(fā)生,并通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出其靶點蛋白,PHB為其4個差異蛋白點之一。因此,本研究通過RNAi技術(shù)獲得人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞株,同時觀察PHB低表達(dá)及不同濃度的COE作用后腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的改變,并探索其作用機制。結(jié)果表明,COE通過調(diào)控PHB來抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,其機制可能與c-Raf/ERK信號通路有關(guān)。本課題研究內(nèi)容共分為三個部分。(一)南蛇藤提取物對人胃癌MGC-803細(xì)胞中PHB表達(dá)水平的影響目的:研究不同濃度南蛇藤提取物(COE)對人胃癌MGC-803細(xì)胞中PHB表達(dá)水平表達(dá)水平的影響。方法:對數(shù)期人胃癌MGC-803細(xì)胞,分別設(shè)置陰性對照組、不同濃度(10,20,40μg/mL)COE加藥組、陽性對照組(5-fu 32 μg/mL、JLC 0.4 mg/mL)。藥物處理細(xì)胞24 h后,收集并提取細(xì)胞的總蛋白,通過蛋白質(zhì)印跡法測定細(xì)胞中PHB蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:COE作用MGC-803細(xì)胞24 h后,隨藥物濃度的增加,PHB表達(dá)水平逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:COE抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞中PHB的表達(dá)水平。(二)人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞株的構(gòu)建及PHB低表達(dá)對MGC-803細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響目的:構(gòu)建PHB低表達(dá)人胃癌MGC-803細(xì)胞株,觀察PHB低表達(dá)對MGC-803細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法:體外培養(yǎng)人胃癌MGC-803細(xì)胞至對數(shù)期,利用RNAi技術(shù),將LV-PHB-RNAi基因整合入MGC-803細(xì)胞DNA,使人胃癌細(xì)胞MGC-803中PHB低表達(dá),同時設(shè)立野生型細(xì)胞組及陰性對照組。轉(zhuǎn)染24h后,倒置熒光顯微鏡下觀察感染后細(xì)胞的熒光強度,收集并提取細(xì)胞總蛋白,Western blot法檢測細(xì)胞中PHB蛋白的表達(dá)。同時,Transwell細(xì)胞侵襲實驗測定PHB低表達(dá)后,MGC-803細(xì)胞侵襲能力的改變。Transwell遷移實驗和細(xì)胞劃痕實驗,檢測PHB低表達(dá)對人胃癌MGC-803遷移能力的影響。同時,Western blot法檢測PHB低表達(dá)后細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及c-Raf/ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)染24h后,倒置熒光顯微鏡下,人胃癌MGC-803細(xì)胞發(fā)出明顯的綠色熒光。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),對比于野生型細(xì)胞Control組及空質(zhì)粒Vehicle組,轉(zhuǎn)染LV-PHB-RNAi細(xì)胞組中PHB蛋白表達(dá)水平明顯下降。PHB低表達(dá)能夠降低人胃癌MGC-803細(xì)胞侵襲遷移能力。同時,PHB低表達(dá)后,間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin,基質(zhì)金屬蛋白(MMP2、MMP9)及c-Raf、ERK1/2、p-ERKl/2表達(dá)水平降低,上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平增加。結(jié)論:成功構(gòu)建人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞株。PHB低表達(dá)抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞的侵襲遷移能力,其機制可能與c-Raf/ERK信號通路有關(guān)。(三)南蛇藤提取物對人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響目的:探討南蛇藤提取物COE對人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法:對數(shù)期人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞,分為陰性對照組(MGC-803/PHB-細(xì)胞,不加藥),不同濃度 COE 組(10,10,20,40,160,320μg/mL)和陽性對照組(5-fu32μg/mL、JLC0.4mg/mL)。MTT比色法觀察藥物作用后MGC-803/PHB-細(xì)胞增殖抑制的影響,并確定下一步COE藥物實驗濃度。Transwell細(xì)胞侵襲實驗觀察藥物作用對細(xì)胞侵襲能力的改變。Transwell細(xì)胞遷移實驗和細(xì)胞劃痕實驗,觀察藥物作用后細(xì)胞遷移能力的影響。藥物作用24 h后,Western blot法檢測不同濃度COE作用后,人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞中EMT相關(guān)分子(包括 E-cadherin、Vimentin、N-cadherin),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及c-Raf/ERK信號通路相關(guān)蛋白(c-Raf、ERK1/2、p-ERKl/2)的表達(dá)變化。結(jié)果:藥物作用細(xì)胞24h、48h、72h后,人胃癌MGC-803/PHB-細(xì)胞的生長受到不同程度的抑制,且具有一定的時間、劑量的依賴性。同時,確定COE非細(xì)胞毒性的濃度梯度為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL,進(jìn)行后續(xù)實驗。藥物作用24h后,與陰性對照組對比,人胃癌MGC-803/PHB-的侵襲遷移能力下降。同時,COE降低Vimentin、N-cadherin、MMP2、MMP9、c-Raf、ERK1/2蛋白的表達(dá)水平,呈濃度依賴性;隨著COE濃度的增加,E-cadherin、p-ERKl/2蛋白的表達(dá)水平上升。結(jié)論:COE抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803/PHB-細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力,其機制可能與c-Raf/ERK信號通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

分析圖像。逡逑２．邋４統(tǒng)計學(xué)處理逡逑以上實驗均己重復(fù)３次或以上，數(shù)據(jù)統(tǒng)計后以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（知Ｓ）表示。以ＳＰＳＳ邋２０．０逡逑分析數(shù)據(jù)，單因素的比較用？檢驗，多均數(shù)的采用方差分析（ＡＮ０ＶＡ），＊，Ｐ＜０．０５表示逡逑有統(tǒng)計學(xué)意義，＊＊，邋Ｐ＜０．０１表示有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。逡逑３結(jié)果逡逑３．１南蛇藤提取物對人胃癌ＭＧＣ－８０３細(xì)胞中ＰＨＢ表達(dá)水平的影響逡逑濃度１０，２０，邋４０邋｜ａｇ／ｍＬ的ＣＯＥ作用于人胃癌ＭＧＣ－８０３細(xì)胞２４邋ｈ后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方逡逑法檢測ＰＨＢ蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同陰性對照組對比，隨著ＣＯＥ濃度的增加，ＣＯＥ處逡逑理組中ＰＨＢ表達(dá)水平逐漸降低，陽性對照組５－ｆｕ與高濃度ＣＯＥ作用相似。表明ＣＯＥ能逡逑夠抑制人胃癌ＭＧＣ－８０３細(xì)胞中ＰＨＢ的表達(dá)水平，具有一定濃度依賴性。逡逑＾邋１５０－逡逑

３．１倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒感染細(xì)胞的熒光表達(dá)逡逑慢病毒轉(zhuǎn)染７２ｈ后，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)，以帶有綠色熒光蛋白的空逡逑質(zhì)粒Ｖｅｈｉｃｌｅ組作為陰性對照組，結(jié)果如圖２所示，慢病毒ＬＶ－ＰＨＢ－ＲＮＡｉ處理組細(xì)胞能觀逡逑察到較強的熒光表達(dá)。逡逑Ｐｈａｓｅ邐ＧＦＰ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑圖２．慢病毒感染后的細(xì)胞熒光表達(dá)（１０0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｒｅｅｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋（１０0ｘ邋）逡逑３．２轉(zhuǎn)染后ＭＧＣ－８０３細(xì)胞中ＰＨＢ蛋白的表達(dá)逡逑慢病毒ＬＶ－ＰＨＢ－ＲＮＡｉ轉(zhuǎn)染后，通過Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔ檢測細(xì)胞內(nèi)ＰＨＢ的表達(dá)水平。對比逡逑野生型細(xì)胞Ｃｏｎｔｒｏ丨組及空質(zhì)粒Ｖｅｈｉｃｌｅ組，ＬＶ－ＰＨＢ－ＲＮＡｉ轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中ＰＨＢ的表達(dá)水平逡逑明顯下降，如閣３所示。提示己成功獲得人肖癌ＭＧＣ－８０３／ＰＨＢｌｍ胞株。逡逑１５０１逡逑！逡逑／，／邋ｒ＿ｎ邋ｎ逡逑ＰＨＢ邋—邋＿邋＾３２ｋＤａ邋ｆ５０＇邐“逡逑Ｐ－ａｃｔｉｉｉ邋—邋＿丨－邐—．ｍ邋４２ｋＤａ邋＾邋0邋｜｜逡逑＃逡逑圖３慢病毒感染后ＰＨＢ蛋白的表徸逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＨＢ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ａｆｔｅｒ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ邋ｔｒａｎｓｆ

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 林明生;王常松;;中醫(yī)藥對胃癌的研究進(jìn)展[J];國醫(yī)論壇;2015年02期

2 劉丹;陳舒華;;Prohibitin與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2014年23期

3 伊日貴;徐曉艷;李時榮;;腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制研究進(jìn)展[J];中華實用診斷與治療雜志;2014年10期

4 季加孚;;我國胃癌防治研究三十年回顧[J];中國腫瘤臨床;2013年22期

5 張華;付強;錢亞云;劉延慶;李國清;崔平方;朱耀東;馬慧;季雪;郭試瑜;久光正;;南蛇藤提取物對人肝癌細(xì)胞增殖、遷移及血管內(nèi)皮生長因子-C表達(dá)的影響[J];中醫(yī)雜志;2013年10期

6 唐娟;曹蘭琴;易紅;湯參娥;;Prohibitin蛋白與卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)性的初步研究[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年12期

7 錢亞云;張華;侯瑩;員林;李國青;郭試瑜;Hisamits Tadashi;劉延慶;;Celastrus Orbiculatus Extract Inhibits Tumor Angiogenesis by Targeting Vascular Endothelial Growth Factor Signaling Pathway and Shows Potent Antitumor Activity in Hepatocarcinomas in Vitro and in Vivo[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2012年10期

8 汪茂榮;;中藥南蛇藤抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J];中醫(yī)學(xué)報;2010年06期

本文編號：2726491