【摘要】：目的:本研究采用基于氣相色譜-質(zhì)譜儀(GC-MS)和超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF-MS)分析方法相結(jié)合的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究血必凈注射液(XBJ)對百草枯(PQ)中毒大鼠的治療效果,通過化學(xué)計(jì)量學(xué)尋找與PQ中毒相關(guān)的代謝物,并探討XBJ干預(yù)后對潛在代謝物的影響,從而初步闡明XBJ的作用機(jī)制,為其在臨床實(shí)踐中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法:按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、PQ組、XBJ干預(yù)組,每組再分為1d、3d、7d、21d亞組,每組6只。PQ組一次性灌胃40mg/kg PQ染毒;對照組大鼠灌胃1mL生理鹽水;XBJ組于灌胃2h后尾靜脈注射XBJ注射液8mL/kg·d;PQ組和對照組尾靜脈注射等量生理鹽水,均給藥7d,在第1d、3d、7d、21d天處死大鼠,收集肺組織和血漿。將右肺上葉進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢查;右肺下葉進(jìn)行病理學(xué)檢查。對血漿樣品分別進(jìn)行不同的預(yù)處理進(jìn)行GC-MS和UPLC-Q-TOF-MS分析,利用儀器自帶軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和轉(zhuǎn)換,導(dǎo)入SMICA-P 14.1和MATLAB軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和隨機(jī)森林分析,再進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA),采用變量重要性投影指標(biāo)(VIP)尋找潛在的差異代謝物,對尋找到的潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行單因素t檢驗(yàn)分析,從而確認(rèn)最終的生物標(biāo)志物,并用MetaboAnalyst 4.0軟件分析其代謝調(diào)控途徑。結(jié)果:(1)病理學(xué)檢測結(jié)果顯示與對照組相比,PQ組在1、3d出現(xiàn)肺水腫和肺出血情況,7d后出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維細(xì)胞增生,21d仍有一定的纖維細(xì)胞增生,提示本實(shí)驗(yàn)肺損傷模型成功。(2)本實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)檢測結(jié)果顯示使用XBJ進(jìn)行干預(yù)后,大鼠的肺損傷程度比PQ組明顯好轉(zhuǎn);本實(shí)驗(yàn)的生化檢測結(jié)果顯示當(dāng)使用XBJ干預(yù)后,各項(xiàng)生化指標(biāo)均有變化,其中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)在3d、7d均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而羥脯氨酸(HYP)在3、7、21d表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明XBJ有助于減少早期PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng),降低HYP含量,改善肺損傷病變過程。(3)經(jīng)過“80%規(guī)則”去除數(shù)據(jù)中的缺失值,通過QC樣品對方法的重現(xiàn)性和精密度進(jìn)行考察,其代謝物的保留時間和含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均符合分析要求。結(jié)合化學(xué)對照品、GC-MS數(shù)據(jù)庫NIST14.0、LC-MS本地標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫、HMDB數(shù)據(jù)庫以及在線數(shù)據(jù)庫對大鼠血漿內(nèi)源性代謝物進(jìn)行定性。采用VIP值和t檢驗(yàn)總共得到了17種與PQ中毒相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物,其中L-纈氨酸、琥珀酸、D-半乳糖、亞油酸、L-色氨酸、油酸、泛酸、硫酸吲哚酚、鞘氨醇1-磷酸、溶血磷脂酰膽堿PC(22:4)、9,10-環(huán)氧十八碳烯酸、8,11,14-二十碳三烯酸等12種代謝物在使用XBJ進(jìn)行干預(yù)后其含量得到回調(diào),而這些代謝物涉及氨基酸代謝、磷脂代謝、脂肪酸代謝、能量代謝以及泛酸和CoA代謝。因此在本項(xiàng)工作中發(fā)現(xiàn)的紊亂代謝途徑對于闡明XBJ的治療作用是有臨床價值的。結(jié)論:(1)本研究通過對PQ中毒大鼠肺組織進(jìn)行病理學(xué)和生化檢查,其結(jié)果表明XBJ對PQ誘導(dǎo)的大鼠肺損傷具有一定的保護(hù)作用。(2)本研究結(jié)果證明了基于GC-MS和UPLC-QTOF-MS代謝組學(xué)的方法可以研究PQ引起的大鼠急性肺損傷的代謝變化,并提供了XBJ緩解PQ引起的急性肺損傷潛在的保護(hù)機(jī)制,這些途徑可能涉及氨基酸代謝、磷脂代謝、脂肪酸代謝、能量代謝以及泛酸和CoA代謝。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

3.1 大鼠模型構(gòu)建與 XBJ 治療效果3.1.1 大鼠染毒情況本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段中探討了 PQ 中毒致大鼠肺損傷的造模效果，分別采用了 20mg/mL、40mg/mL、80mg/mL 的 PQ 中毒劑量，發(fā)現(xiàn) 20mg/mL 的肺損傷效果不明顯，而 80mg/mL 的劑量會造成有些大鼠在短期內(nèi)死亡，綜合考慮到本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)時間長短以及主要目的是為了探討 XBJ 的治療效果以及作用機(jī)制，再結(jié)合文獻(xiàn)資料最終選擇 40mg/mL 作為本研究方案的最終造模濃度。染毒組大鼠在染毒 2～4h 后出現(xiàn)運(yùn)動遲緩、身體蜷縮、精神不振；6h 后出現(xiàn)氣息不穩(wěn)、呼吸急促；2～3d 大鼠表現(xiàn)最差，出現(xiàn)心率加快、四肢無力、精神萎靡、毛發(fā)蓬松柔軟、眼神渙散、進(jìn)食水量明顯減少，體重明顯下降；5d 后中毒表現(xiàn)有所緩解。XBJ 干預(yù)組在 2d 前無明顯差異，3d 后表現(xiàn)明顯較染毒組輕，飲食量增加，體重增加；對照組無明顯異常。體重變化詳見圖 3-1。

圖 3-2 不同組之間的肺組織病理學(xué) HE 染色圖（×200 倍）Fig. 3-2 HE staining of lung histopathology between different groups表 3-1 XBJ 對 PQ 中毒后各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響Tab. 3-1 Effect of XBJ on the changes of various biochemical indicators after PQpoisoning生化指標(biāo)組別/時間點(diǎn)1d 3d 7d 21dSOD（U/mgprot)controlgroup231.61±12.35 255.86±21.98 237.97±12.54 189.44±18.36PQ group 191.95±6.6** 195.3±21.05** 213.11±24.03 181.07±27.82XBJ group 200.98±36.56 250.83±34.66##256.69±26.95##198.75±42.44MDA（nmol/mgprot)controlgroup0.6±0.04 0.65±0.03 0.62±0.04 0.74±0.05PQ group 0.75±0.09** 0.77±0.04** 0.74±0.03** 0.73±0.04XBJ group 0.65±0.1#0.68±0.07##0.61±0.05##0.68±0.05control

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