【摘要】：1.目的:通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn),建立大鼠椎間盤退變模型,予高中低濃度淫羊藿苷口服,按照實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn),通過Western blot和Real-time PCR法檢測(cè)炎性因子IL-1β,IL-6的表達(dá)情況,并利用MRI觀察椎間盤退變程度、HE染色觀察椎間盤形態(tài)及免疫組化染色法檢測(cè)椎間盤髓核(nucleus pulposus,NP)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)Agg,coⅢ表達(dá)情況。體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)大鼠退變髓核細(xì)胞分泌炎性因子IL-6、IL-lp以及髓核細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)Agg,coⅢ的影響。通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)明確淫羊藿苷是否影響大鼠退變髓核細(xì)胞分泌炎性因子,進(jìn)而延緩椎間盤退變。2.方法:2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將60只SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(Sham)、椎間盤退變組(IDD)及低中高濃度淫羊藿苷(ICA)組(ICAL,ICAM,ICAH),每組12只。采用穿刺大鼠尾椎間盤法制備IDD模型。術(shù)后對(duì)各組大鼠灌胃。ICA組分別灌胃ICA(25,50,100 mg/kg.d),Sham及IDD組給予等量生理鹽水灌胃。術(shù)后2w及6w將大鼠麻醉進(jìn)行MRI檢查。術(shù)后2w及6w進(jìn)行取材,用Western blot和Real-time PCR法檢測(cè)炎性因子IL-1β,IL-6的表達(dá)情況;HE染色觀察椎間盤形態(tài);免疫組化染色觀察NP內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)Agg,coⅢ表達(dá)情況。2.2體外實(shí)驗(yàn)將Sham提取的NP細(xì)胞標(biāo)記為對(duì)照組(Control),IDD組提取的NP隨機(jī)均分為4組(IDD、ICAL、ICAM及ICAH),ICA組用不同濃度ICA(10,20,40μM)處理24h,Control與IDD組則加入等量培養(yǎng)基。采用CCK-8測(cè)定NP細(xì)胞的增值能力。細(xì)胞免疫熒光,通過成像系統(tǒng)觀察采集圖像。收集各組NP細(xì)胞用于Western blot和Real-time PCR檢測(cè)IL-1β,IL-6表達(dá)量,用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)收集上清液中IL-1β,IL-6水平。3.結(jié)果3.1 ICA可以抑制IL-1β,IL-6表達(dá),促進(jìn)Aggrecan,CollagenⅡ表達(dá)術(shù)后2w及6w兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),Western blot和Real-time PCR結(jié)果均顯示IDD組NP組織中IL-1β,IL-6表達(dá)量高于Sham及各濃度ICA組,而免疫組化顯示IDD組Aggrecan,CollagenⅡ的表達(dá)量則低于其它組,表明IDD過程中炎癥因子IL-1β,IL-6表達(dá)上調(diào)及胞外基質(zhì)AggrecaⅡ,CollagenⅡ表達(dá)下調(diào);ICA可以抑制IL--1β,IL-6表達(dá),促進(jìn)Aggrecan,CollgenⅡ表達(dá)。3.2 ICA可減輕大鼠椎間盤穿刺引起的退變7.0T MRR圖像所示,比較IDD組與ICAM組穿刺椎間盤的T2加權(quán)信號(hào)強(qiáng)度:術(shù)后2w,,ICAM組信號(hào)強(qiáng)于IDD組;術(shù)后6w,IDD組信號(hào)消失,ICAM組則無明顯改變。ICAM組Pfirrmann MRI等級(jí)評(píng)分(表明椎間盤退變程度)明顯低于IDD組。術(shù)后6w的的E染色顯示,與Shhm組相比,IDD組椎間盤退變嚴(yán)重,纖維環(huán)破裂呈斷層狀,層間空隙增寬,椎間盤內(nèi)NP組織體積較小,形態(tài)不規(guī)則排列無序,NP細(xì)胞數(shù)量大量較少,形態(tài)呈類軟骨樣細(xì)胞樣改變;;而ICAA組在細(xì)胞外基質(zhì)含量、纖維環(huán)及NP細(xì)胞形態(tài)方面均優(yōu)于IDD組。3.3 ICA促進(jìn)退變NP細(xì)胞增殖據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道分別給予不同濃度ICA(10,20及44μM)處理ICA組NP細(xì)胞。采用CK-8法測(cè)定NP細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示IDD組NP細(xì)胞增殖力明顯低于control及ICA組,表明ICA促進(jìn)退變NP細(xì)胞增殖。3.4.ICA抑制NP細(xì)胞IL-1β,IL-6表達(dá)體外實(shí)驗(yàn)中,Real-time PCR及ELSIA結(jié)果顯示:與Control組相比,IDD組NP細(xì)胞IL-1β,IL-6表達(dá)顯著上調(diào)。ICA處理后與IDD組比較,NP細(xì)胞L--1,,L-6表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。免疫熒光顯示:與IDD組相比,,ICA組NP細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)上聚集的的IL-1β、IL-6熒光強(qiáng)度更弱。3.5.ICA抑制胞外基質(zhì)Aggrecan,Collagen Ⅱ降解根據(jù)Western blot及Real-time PCR結(jié)果所示,與與control組相比,IDD組NP細(xì)胞外質(zhì)Aggrecan和和collagenⅡ表達(dá)水平顯著降低,,而ICA處理后可以提高Aggrecan和和collagenⅡ表達(dá)水平。4.結(jié)論:淫羊藿苷可以減輕體內(nèi)大鼠椎間盤退變,促進(jìn)退變髓核細(xì)胞增殖,并抑制炎癥因子表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)降解,因此可能成為治療椎間盤退變的藥物。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖１注：術(shù)后２ｗ時(shí)，ＩＣＡ對(duì)ＩＤＤ大鼠ＮＰ組織中ＩＬ－ｉｐ與ＩＬ－６表達(dá)的影響。（Ａ－Ｃ）ＮＰ中ＩＬ－ｉｐ逡逑與ＩＬ－６蛋白相對(duì)表達(dá)量。（Ｄ－Ｅ）ＮＰ中ＩＬ－ｉｐ與ＩＬ－６ｍＲＮＡ相對(duì)表達(dá)量。與ＩＤＤ組相比，＊Ｐ＜０．０５，逡逑ｎ＝６。與邋Ｓｈａｍ邋組相比，＃Ｐ邋＜邋０．０５，ｎ＝６。逡逑３．２術(shù)后６ｗ邋ＩＬ－ｉｐ，邋ＩＬ－６在ＮＰ組織中的表達(dá)逡逑術(shù)后６ｗ時(shí)，根據(jù)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ結(jié)果，所得結(jié)論與術(shù)后２ｗ相同，再逡逑次表明高中低劑量ＩＣＡ均可以抑制ＮＰ組織中ＩＬ－ｌｐ，邋ＩＬ－６的表達(dá)。（圖２）逡逑泰逡逑

３．２術(shù)后６ｗ邋ＩＬ－ｉｐ，邋ＩＬ－６在ＮＰ組織中的表達(dá)逡逑術(shù)后６ｗ時(shí)，根據(jù)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ結(jié)果，所得結(jié)論與術(shù)后２ｗ相同，再逡逑次表明高中低劑量ＩＣＡ均可以抑制ＮＰ組織中ＩＬ－ｌｐ，邋ＩＬ－６的表達(dá)。（圖２）逡逑泰逡逑１２逡逑

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本文編號(hào)：2724810