【摘要】：第一部分目的:研究棕櫚酸(PA)在HK-2細胞凋亡中發(fā)揮的作用以及黃芪甲苷(Astragaloside IV,ASIV)在PA誘導HK-2細胞凋亡中的保護作用,為ASIV在糖尿病腎病的防治中提供相關(guān)理論依據(jù)。方法:體外培養(yǎng)HK-2細胞,對其分組如下:牛血清白蛋白(BSA)對照組、PA組與ASⅣ不同劑量(10,20,40μmol/L)給藥組。MTT法檢測細胞活性;油紅染色法觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況;BODIPY?FL C16熒光染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)運輸情況;Hoechst-33258、Annexin-V/FITC/PI雙標記熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況;ROS活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS表達情況;Western blot測定HK-2細胞內(nèi)ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3、p-Nrf2蛋白表達情況。結(jié)果:ASⅣ濃度在0-100μmol/L時對HK-2細胞生長沒有明顯影響;結(jié)果顯示200μmol/L的棕櫚酸能夠誘導HK-2細胞的凋亡,增加細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,誘導細胞內(nèi)氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生。ASIV(10,20,40μmol/L)可以明顯減少棕櫚酸誘導的HK-2細胞的凋亡數(shù)目,降低細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,減少細胞內(nèi)活性氧含量。棕櫚酸誘導后HK-2細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白ATF4、CHOP表達升高,氧化應激相關(guān)蛋白p-Nrf2含量降低,凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase 3表達增加。而給予ASIV后,可以明顯降低ATF4、CHOP、Bax、Cleaved-caspase 3含量,并升高p-Nrf2的含量。結(jié)論:ASⅣ能夠抑制棕櫚酸(PA)誘導HK-2細胞的凋亡,其作用機制可能與ASⅣ能夠降低凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3的含量,可以減少細胞內(nèi)ROS的含量,升高HK-2細胞內(nèi)Bcl-2和p-Nrf2的表達水平有關(guān)。第二部分目的:研究ASIV在保護HK-2細胞防止其凋亡的過程中,其發(fā)揮保護作用的具體機制。進一步探討氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在HK-2細胞凋亡過程中的作用。方法:體外培養(yǎng)HK-2細胞,對其分組如下:牛血清白蛋白(BSA)對照組、PA組、ASⅣ40μmol/L給藥組、Tempol給藥組以及4苯基丁酸(4-phenybutyric acid,4-PBA)給藥組。MTT法檢測細胞活性;Hoechst-33258、Annexin-Ⅴ/FITC/PI雙標記熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況;ROS活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS沉積情況;Western blot測定HK-2細胞內(nèi)ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3、P-nrf2蛋白表達情況。結(jié)果:細胞給予Tempol或者4-PBA后均可改善細胞凋亡情況,減少細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達。氧化應激抑制劑Tempol,不僅能夠降低細胞內(nèi)ROS的含量,升高p-Nrf2蛋白含量,而且也能改變細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的含量,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡蛋白ATF4、CHOP的表達;同樣我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-PBA,不僅能夠降低相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白含量,也能夠改善細胞內(nèi)氧化應激反應情況,降低細胞內(nèi)ROS含量,并增加p-Nrf2蛋白的表達。結(jié)論:棕櫚酸(PA)誘導HK-2細胞凋亡的機制可能與PA刺激后細胞內(nèi)發(fā)生的氧化應激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應有關(guān)。ASIV對PA誘導的HK-2細胞的損傷具有保護作用,ASIV的保護機制可能是由于ASIV能夠降低氧化應激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相關(guān)反應,從而起到細胞的保護作用。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1 光學顯微鏡下觀察各組細胞不同形態(tài)(200×)Fig.1 Cell morphology and viability test. (A): Normal cells. (B): BSA control cells. (C): PA 24 hours afterstimulation cells. (200×)

圖 2. PA 和 ASIV 對 HK-2 細胞活力的影響(MTT 法)ffect of PA and ASIV on HK-2 cell viability (MTT). (A): The cytotoxicity of ASIV with difftrations, (B): The cytotoxicity of PA with different concentrations, (C): The protective effect of ASIell damage induced by PA. Data were expressed as mean ± SD, n=3,**p < 0.01,***p< 0.001 ve

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本文編號：2724573