【摘要】：目的:研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯(DBT)促骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)粘附作用和遷移能力及其機(jī)制;探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控造血的能力。方法:一、分別以阿魏酸和芒柄花素作為當(dāng)歸和黃芪的中藥標(biāo)志物,利用中藥指紋圖譜構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn);二、利用MTT法優(yōu)化骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)最佳細(xì)胞培養(yǎng)密度和藥物使用劑量;根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期和長(zhǎng)期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察DBT對(duì)BMSCs在體外培養(yǎng)的影響。采用粘附實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)探索DBT對(duì)BMSCs細(xì)胞粘附和遷移的作用。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察黏附蛋白的表達(dá)和細(xì)胞骨架的改變;三、轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)從基因水平分析DBT改變BMSCs細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況,預(yù)測(cè)BMSCs粘附作用的機(jī)制通路;利用Q-PCR法和Western Blot分別從基因和蛋白角度驗(yàn)證Focal Adhesion通路對(duì)BMSCs粘附作用的影響;四、統(tǒng)計(jì)DBT處理后懸浮細(xì)胞數(shù)目反映造血細(xì)胞的變化趨勢(shì);細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)是反映造血細(xì)胞細(xì)胞周期的間接指標(biāo);利用流式細(xì)胞儀分析造血系細(xì)胞中早/中/晚期紅系細(xì)胞比例;CFU-E實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DBT促紅系祖細(xì)胞向成熟紅系分化的能力。結(jié)果:分別以阿魏酸和芒柄花素作為當(dāng)歸和黃芪的中藥標(biāo)志物,利用高效液相色譜(HPCL)法分析當(dāng)歸補(bǔ)血湯的色譜圖。其中,阿魏酸和芒柄花素的洗脫時(shí)間分別是25 min和59 min,同時(shí)阿魏酸和芒柄花素分別在323.4 nm和249.9 nm有最大吸收峰,經(jīng)過(guò)比對(duì)分析證實(shí)當(dāng)歸補(bǔ)血湯中也存在著這兩種物質(zhì)。三次獨(dú)立樣本指紋圖譜與實(shí)驗(yàn)室以前的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度達(dá)到了97.4%,RSD為1.22%,說(shuō)明三次獨(dú)立提取DBT成分從整體的角度基本一致。同一樣本不同時(shí)間點(diǎn)獲得指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.95,RSD為0.67%。說(shuō)明樣品在24h內(nèi)能保持較好的穩(wěn)定性。在之前的研究基礎(chǔ)下,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)密度范圍為3.2×10~6~4.8×10~6個(gè)/mL(1×10~6~1.5×10~6個(gè)/cm2)和劑量范圍為0.5mg/mL~16 mg/mL。低濃度DBT可以促進(jìn)BMSCs數(shù)目增加,延長(zhǎng)了細(xì)胞在體外的培養(yǎng)時(shí)間,細(xì)胞周期出現(xiàn)抑制作用。并且低濃度DBT還可以促進(jìn)BMSCs細(xì)胞黏附和遷移能力。熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)DBT處理組BMSCs黏著斑蛋白表達(dá)增多,細(xì)胞骨架也明顯改變,有明顯偽足出現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)BMSCs基因差異表達(dá)與黏附機(jī)制有關(guān),并與Focal Adhesion信號(hào)通路相關(guān)性最強(qiáng)。Q-PCR和WB實(shí)驗(yàn)分別從基因水平和蛋白水平驗(yàn)證了DBT通過(guò)激活Focal adhesion信號(hào)通路促進(jìn)黏著斑的表達(dá)和細(xì)胞骨架蛋白的重排,從而影響B(tài)MSCs的粘附和遷移能力。與骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)36 h,DBT處理組的懸浮細(xì)胞數(shù)目有下降趨勢(shì)但無(wú)明顯差異,細(xì)胞周期也無(wú)明顯影響。當(dāng)DBT處理30 h時(shí),早期和中期紅系細(xì)胞的數(shù)目和比例顯著升高,晚期紅系細(xì)胞數(shù)目和比例顯著降低。低濃度的DBT可以促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的未分化能力增強(qiáng),但隨著濃度的增加紅系祖細(xì)胞未分化能力減弱。結(jié)論:當(dāng)歸補(bǔ)血湯有助于骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng),促進(jìn)細(xì)胞增殖,粘附能力和遷移能力。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以通過(guò)Focal adhesion信號(hào)通路促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)黏著斑蛋白,促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白重排。當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能是通過(guò)影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附作用間接促進(jìn)造血祖細(xì)胞分化成紅細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.3 結(jié)果阿魏酸和芒柄花素成分分析為了后期實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，以當(dāng)歸中的阿魏酸和黃芪中的芒柄花素作為質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)，利用高效液相色譜法分析了當(dāng)歸補(bǔ)血湯的圖譜。在前人的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)利用了 Agilent poroshell 120 EC-C18 色譜柱和已經(jīng)優(yōu)化過(guò)的甲醇-水-冰乙酸流動(dòng)相，分別獲得了阿魏酸、芒柄花素和當(dāng)歸補(bǔ)血湯的全波長(zhǎng)掃描圖（1A，1C 和 1E）。同時(shí)獲得該樣品在最高可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)時(shí)的光譜圖（1B 和 1D）。其中，阿魏酸和芒柄花素的洗脫時(shí)間分別是 25min 和 59min，同時(shí)阿魏酸和芒柄花素分別在 323.4nm 和 249.9nm 有最高的可見(jiàn)范圍內(nèi)吸收值，經(jīng)過(guò)比對(duì)洗脫時(shí)間和峰的全波長(zhǎng)掃描圖，說(shuō)明當(dāng)歸補(bǔ)血湯中也存在著這兩種物質(zhì)。

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文peak diagram of DBT at 249nm.指紋圖譜相似度分析取三次分別提取的 DBT 供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 3 次，考察色譜圖相似度、色譜峰保留時(shí)間。結(jié)果顯示，直觀觀察指紋圖譜的整體圖形無(wú)明顯波動(dòng)。用評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A），統(tǒng)計(jì)三次獨(dú)立提取DBT指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度達(dá)到了97.4%，RSD 為 1.22%，說(shuō)明三次分別提取的 DBT 成分從整體的角度來(lái)看基本一致。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2724711