【摘要】：地黃為我國大宗中藥,根據(jù)炮制方法不同,其作用上有著較大差異�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)地黃具有抗老年癡呆、保護(hù)胃黏膜、保護(hù)心血管系統(tǒng)以及抗腫瘤等多種藥理作用。有研究表明地黃在腎纖維化治療中能發(fā)揮積極作用,其機(jī)理可能與下調(diào)TβRⅠ和Smad2 mRNA表達(dá),同時上調(diào)Smad7mRNA表達(dá)有關(guān)。因此,地黃能否抑制肺間質(zhì)纖維化值得深入探究。本研究內(nèi)容包括:1)HPLC測定不同方式提取液中梓醇、益母草苷和毛蕊花糖苷含量,優(yōu)化藥物提取條件。2)通過病理觀察,比較得出制備小鼠肺纖維化模型的最佳方案。3)觀察地黃防治后模型小鼠肺組織病理變化,比較炎癥與纖維化程度,檢測膠原蛋白特征指標(biāo)、肺部氧化損傷指標(biāo)及致纖維化信號通路相關(guān)蛋白,比較地黃不同炮制品對肺間質(zhì)纖維化作用差異,并探究作用機(jī)理。試驗一基于HPLC的地黃提取液成分檢測使用回流與超聲兩種方式分別制備干地黃、生地黃和熟地黃藥材20%、60%以及100%甲醇溶液提取液,HPLC分別檢測提取液中梓醇、益母草苷及毛蕊花糖苷含量,并考察含目標(biāo)成分最高提取液24h穩(wěn)定性。結(jié)果顯示:相同提取方法,隨甲醇濃度提高,梓醇、益母草苷以及毛蕊花糖苷等目標(biāo)成分提取效率明顯降低,20%甲醇提取液目標(biāo)成分含量最高。20%甲醇回流提取,干地黃梓醇提取率15.4mg/g,益母草苷提取率2.1mg/g,毛蕊花糖苷提取率0.4mg/g;生地黃梓醇提取率6.6mg/g,益母草苷提取率0.7mg/g,毛蕊花糖苷提取率0.3mg/g;熟地黃中梓醇提取率0.3mg/g,益母草苷提取率0.1mg/g,毛蕊花糖苷提取率0.2mg/g。20%甲醇超聲或回流提取對目標(biāo)成分提取率影響不大。24h穩(wěn)定性試驗發(fā)現(xiàn):20%甲醇提取液中3種目標(biāo)成分24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。提示20%甲醇回流提取1.5h(5次)為制備地黃提取液最佳方案,鮮地黃加工成生地黃和熟地黃后,梓醇、益母草苷和毛蕊花糖苷含量均大幅降低。試驗二不同劑量BLM對小鼠肺組織纖維化程度影響研究試驗小鼠分為4組,即O組、L組、M組合H組,每組30只。均采用腹腔注射BLM40mg/kg·2d,連續(xù)注射4次(L組)、5次(M組)和6次(H組)造模;空白組注射無菌生理鹽水。造模開始后每日觀察小鼠精神、皮毛、呼吸、運(yùn)動及死亡等情況。并于試驗第21d、28d和35d隨機(jī)抽取各組存活小鼠,撲殺采集肺臟制作病理切片,用Szapiel方法評價比較不同注射次數(shù)不同時期小鼠肺部炎癥與纖維化病變程度。結(jié)果顯示:模型小鼠在試驗14～28d間出現(xiàn)死亡,其中L組死亡率0%,M組死亡率30%,H組死亡率50%。存活小鼠病理切片HE染色顯示:肺部炎癥水平與BLM給藥次數(shù)呈正相關(guān),并且隨著時間的延長炎癥逐漸加劇。Masson染色顯示:在21d僅有H與M組出現(xiàn)少量病理膠原沉積,而第28d時3模型組均出現(xiàn)明顯膠原沉積,但L組僅有少量散在的條索狀膠原沉積,M和H組肺組織則出現(xiàn)大面積黏連成片的膠原;至第35d,L組肺纖維化仍在加重,M與H組小鼠肺纖維化程度明顯減輕。提示5次腹腔注射BLM 40mg/kg·2d,試驗第28d小鼠肺部即出現(xiàn)大量膠原沉積,且該劑量僅有30%的小鼠死亡,可作為小鼠肺間質(zhì)纖維化造模的推薦方法。試驗三地黃防治肺纖維化效果及機(jī)理探究將試驗小鼠分為空白對照組、模型組、鮮地黃防治組、生地黃防治組和熟地黃防治組,用連續(xù)5次腹腔注射BLM40mg/kg·2d造模,試驗1～23d每日灌胃給給予相應(yīng)地黃提取液(原生藥2.97g/kg·d),28d撲殺采樣,取部分肺臟制作病理切片,評價肺部炎癥和纖維化水平;制備肺組織勻漿,檢測各組小鼠肺組織羥脯氨酸(堿水解法),測定氧化損傷指標(biāo)MDA(TBA法)、SOD(WST-1法)和GSH-px(比色法),比較各組小鼠肺組織纖維化水平、氧化損傷程度和抗氧化能力;Western blot法測定TGF-β1/Smads通路蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果顯示:干地黃、生地黃和熟地黃均能夠不同程度減輕模型小鼠肺部纖維化和炎癥,降低肺組織膠原水平。但干地黃提取物對肺纖維化防治效果弱于生地黃和熟地黃提取物。各地黃防治組小鼠與模型組相比肺組織MDA水平極顯著降低(P0.01),而GSH-px酶活力顯著增高(P0.05),同時SOD酶活力也略有升高(P0.05),說明三種地黃能通過提高GSH-px酶活力而增強(qiáng)肺組織的抗氧化損傷能力,保護(hù)肺組織。TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白測定結(jié)果顯示:生地黃和熟地黃防治組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)較模型組極顯著降低(P0.01),Smad2/3蛋白表達(dá)明顯減少(P0.05),而干地黃差異不顯著(P0.05)。3種地黃對TβRⅠ、TβRⅡ、Smad4、Smad6和Smad7蛋白表達(dá)均無明顯影響。提示生地黃與熟地黃能夠有效減輕肺組織損傷和膠原蛋白沉積,抑制肺纖維化發(fā)展。結(jié)論:20%甲醇回流(1.5h,5次)為地黃最佳提取方案;連續(xù)5次腹腔注射BLM 40mg/kg.2d可成功制備小鼠肺間質(zhì)纖維化模型,28d肺部纖維化病變明顯可見。持續(xù)給藥地黃提取液(原生藥7.95g/kg.d)23日,生地黃和熟地黃明顯減輕小鼠肺部炎癥和肺纖維化水平,其作用機(jī)制與增強(qiáng)小鼠抗氧化損傷能力和抑制TGF-β1/Smads通路信號傳導(dǎo)作用有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

邐謝鑫鋒地黃對博來霉素致小鼠肺纖維化防治效果探宄邐１９逡逑精密吸�。�0Ｈ丨各供試品在相應(yīng)條件下進(jìn)樣檢測，根據(jù)目標(biāo)峰面積和回歸方程進(jìn)行相應(yīng)逡逑成分含量計算。逡逑２結(jié)果與分析逡逑２．邋１各目標(biāo)組分洗脫時間逡逑在相應(yīng)條件下標(biāo)準(zhǔn)品溶液和鮮地黃２０％甲醇回流提取液的ＨＰＬＣ圖如下，標(biāo)準(zhǔn)品溶溶逡逑液ＨＰＬＣ圖譜可見：梓醇洗脫時間約為ｌＯｍｉｎ（圖ｌ－１－ａ），益母草苷洗脫時間約為２７ｍｉｎ３０ｓ逡逑（圖ｌ－２－ｃ），毛蕊花糖苷洗脫時間約為１８ｍｉｎ３０ｓ邋（圖ｌ－３－ｅ）。在鮮地黃２０％甲醇回流提逡逑取液ＨＰＬＣ可見：ｌＯｍｉｎ的梓醇峰（ｌ－１－ｂ），２７ｍｉｎ３０ｓ的益母草苷峰（ｌ－２－ｄ），１８ｍｉｎ３０ｓ逡逑的毛蕊花糖苷峰（ｌ－３－ｆ）。逡逑■邐＾邐校順ｒｎ？而ｍ逡逑

圖Ｋ３：毛蕊花糖苷ＨＰＬＣ圖：標(biāo)準(zhǔn)品圖（ｅ），鮮地黃２０％甲醇提取液（ｄ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｕ３邋ＨＰＬＣ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ：邋Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ邋（ｅ），邋Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ邋ｉｎ邋Ｒｅｈｍａｎｎｉａ邋ｒｅｈｍａｎｎｉａ邋（ｆ）逡逑２．邋２精密度試試驗逡逑根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積計算相應(yīng)條件下ＲＳＤ邋（ｎ＝６），結(jié)果如下：梓醇ＲＳＤ＝１．１０％，逡逑益母草苷ＲＳＤ＝］．６０％，毛蕊花糖苷ＲＳＤ＝１．０７％，表明儀器精密度良好。逡逑２．邋３標(biāo)準(zhǔn)曲線方程逡逑根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測試驗結(jié)果計算出各成分回歸方程方程，結(jié)果如表１－１所示。逡逑表丨－１各標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑組別邐回歸方程邐ｒ邐線性范圍ｎｇ．ｍｌ－１邐逡逑梓醇邐Ｙ＝邋０．０００２Ｘ邋＋邋４．７５８５邋ｒ邋＝邋０．９９９７邐５０－４００逡逑益母草苷邐Ｙ邋＝邋０．０００１Ｘ－邋０．４９６邐ｒ＝１．００００邐１－１５０逡逑毛蕊花糖苷邐Ｙ＝０．００００５Ｘ邋－邋０．４０８Ｓ邋ｒ＝０．９９９９邐０．５－５０邐邐逡逑

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