【摘要】：研究一食源性肥胖SD大鼠2型糖尿病模型的實(shí)驗(yàn)研究背景:高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)是實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病模型最常用的的造模方法,該方法已被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病及2型糖尿病腎病的研究中。研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食喂養(yǎng)可誘導(dǎo)部分動物形成食源性肥胖模型。食源性肥胖動物模型具有明顯的胰島素抵抗特征,利用該模型注射小劑量STZ形成2型糖尿病模型的成功率比常規(guī)造模方法明顯提高。但是,高脂飲食僅能誘導(dǎo)大約50%的動物產(chǎn)生食源性肥胖,因此需探討如何提高食源性肥胖成模率。同時,STZ的注射劑量與2型糖尿病成模率直接相關(guān),但是目前尚無統(tǒng)一的STZ注射量標(biāo)準(zhǔn),因此仍需繼續(xù)探討STZ的注射劑量。目的:通過觀察給予不同高脂飲食配方后大鼠的食源性肥胖成模情況,尋求建立食源性肥胖大鼠模型較佳的造模方式;在食源性肥胖大鼠模型的基礎(chǔ)上探討不同STZ劑量對建立2型糖尿病大鼠模型的影響,為制備2型糖尿病大鼠模型提供參考依據(jù)。方法:本實(shí)驗(yàn)分為兩大步驟,第一步先制造食源性肥胖大鼠模型,第二步在食源性肥胖大鼠模型的基礎(chǔ)上注射小劑量STZ制造2型糖尿病大鼠模型。第一步:雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、高脂高糖飼料組和三聯(lián)法組。空白組給予普通飼料喂養(yǎng),高脂高糖飼料組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),三聯(lián)法組給予高脂高糖飼料自由進(jìn)食+高脂乳制灌胃+蔗糖水自由飲用。高脂高糖喂養(yǎng)第6周末稱量體重,若體重≥空白組體重均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差者為食源性肥胖大鼠,納入食源性肥胖大鼠,其余不達(dá)標(biāo)者淘汰。納入食源性肥胖大鼠后,稱量大鼠體重并用代謝籠收集和計算各組大鼠一天的進(jìn)食量、飲水量和尿量。第二步:各組大鼠禁食12小時后,按照注射劑量不同,將食源性肥胖大鼠隨機(jī)分為A組(原高脂高糖飼料組,STZ 26mg/kg)、B組(原高脂高糖飼料組,STZ 28mg/kg)、C組(原高脂高糖飼料組,STZ 30mg/kg)、D組(原三聯(lián)法組,STZ 26mg/kg)、E組(原三聯(lián)法組,STZ 28mg/kg)、F組(原三聯(lián)法組,STZ 30mg/kg),空白組腹腔注射同等劑量檸檬酸鈉緩沖液。各組于注射STZ后7天、14天、21天、28天經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖,連續(xù)4次空腹血糖≥11.lmmol/L者為2型糖尿病大鼠。納入2型糖尿病大鼠后,稱量大鼠體重并用代謝籠收集和計算各組大鼠一天的進(jìn)食量、飲水量和尿量。注射STZ后第31天取材,采血檢測空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯和胰島素,并取部分胰腺組織進(jìn)行HE染色。結(jié)果:(1)經(jīng)過6周的高脂高糖飲食后,三聯(lián)法組食源性肥胖的成模率(81.25%)明顯高于高脂高糖飼料組的成模率(47.92%),有顯著性差異(P0.05)。(2)注射STZ 4周后,A～F組與自身注射STZ前比較,進(jìn)食量、飲水量、尿量均明顯升高,有顯著性差異(P0.05),體重明顯下降,有顯著性差異(P0.05),出現(xiàn)明顯的“三多一少”現(xiàn)象。(3)注射STZ后第31天,與空白組相比,A～F組的空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均明顯升高,有顯著性差異(P0.05)。(4)注射STZ后第31天,與空白組相比,A～F組的胰腺組織HE染色可見胰島組織明顯萎縮,胰島數(shù)量與細(xì)胞數(shù)減少,部分胰島細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)沉積等病理改變。(5)注射STZ后的31天內(nèi),C組和F組(STZ 30mg/kg劑量組)有動物死亡,但是A～F組存活率沒有顯著差異(P0.05);E組(STZ 28mg/kg劑量組)的2型糖尿病成模率高于D組(STZ 26mg/kg劑量組),有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:(1)連續(xù)6周三聯(lián)法喂養(yǎng)是建立食源性肥胖大鼠模型的較佳方法。(2)連續(xù)6周三聯(lián)法喂養(yǎng)聯(lián)合一次性腹腔注射STZ 28mg/kg是建立2型糖尿病模型的較佳方法。研究二 理中湯抑制2型糖尿病大鼠腎臟纖維化的作用和機(jī)制研究背景:糖尿病是最常見的代謝性疾病,其發(fā)病類型以2型糖尿病為主。糖尿病腎病是糖尿病主要的慢性微血管并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。研究報道,約有20%～30%的2型糖尿病患者會發(fā)生糖尿病腎病,隨著2型糖尿病的發(fā)病率升高,糖尿病腎病的發(fā)病率也逐漸升高,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。西方醫(yī)學(xué)中的“糖尿病”與中醫(yī)學(xué)中的“消渴”相類似。中醫(yī)藥治療消渴源遠(yuǎn)流長,積累了許多經(jīng)驗(yàn)�？偨Y(jié)古今治療消渴的用藥經(jīng)驗(yàn),可以發(fā)現(xiàn)“氣虛”是貫穿消渴始終的基本病機(jī)。同時,從“治未病”角度出發(fā),治療消渴腎病應(yīng)當(dāng)先溫陽健脾,補(bǔ)后天以養(yǎng)先天。因此,我們認(rèn)為治療早期消渴腎病宜采用“益氣溫陽健脾”療法。理中湯是臨床治療糖尿病及其并發(fā)癥的常用方,具有溫中祛寒、益氣健脾之功,故針對早期消渴腎病可選用理中湯治療。但是目前關(guān)于理中湯對2型糖尿病腎病的研究較少,有待進(jìn)一步深入探討和研究。目的:通過觀察理中湯對2型糖尿病大鼠一般情況、腎重指數(shù)、腎功能、腎組織形態(tài)、腎皮質(zhì)VEGFA、TGF-β 1、COL-1蛋白表達(dá)和miR-200b基因表達(dá)的影響,證實(shí)理中湯對2型糖尿病大鼠腎臟有抗纖維化作用并初步探討其機(jī)制所在。方法:將雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組和造模組�？瞻捉M給予普通飼料和動物房飲用水喂養(yǎng),造模組給予高脂高糖飼料自由進(jìn)食+高脂乳制灌胃+蔗糖水自由飲用三聯(lián)法喂養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)6周后稱量體重,若體重≥空白組體重均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差者為食源性肥胖大鼠,納入食源性肥胖大鼠,其余全部淘汰。納入食源性肥胖大鼠后,造模組停止高脂高糖乳制和蔗糖水喂養(yǎng),改為高脂高糖飼料和動物房飲用水喂養(yǎng),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。然后對納入的食源性肥胖大鼠一次性腹腔注射1%STZ 28mg/kg,空白組腹腔注射同等劑量檸檬酸鈉緩沖液。造模組于注射STZ后7天、14天、21天、28天經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖,連續(xù)4次空腹血糖≥11.1mmmol/L,且伴有多飲、多食、多尿現(xiàn)象者確定為2型糖尿病大鼠。然后將2型糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、氯沙坦鉀組和理中湯組3組。氯沙坦鉀組給予氯沙坦鉀灌胃,理中湯組給予理中湯灌胃,空白組和模型組給予同等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)干預(yù)12周。干預(yù)12周末用代謝籠收集大鼠24小時尿液并記錄尿量,檢測24h尿微量白蛋白。干預(yù)12周后取材,采血檢測空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、尿素氮、血肌酐、糖化血紅蛋白和空腹胰島素,并計算胰島素抵抗指數(shù):稱量體重與雙腎重量,計算腎臟重量指數(shù)(腎重/體重);取部分腎皮質(zhì)組織用于HE、PAS、PASM、MASSON染色和電鏡標(biāo)本制作,并利用軟件分別計算PAS、PASM、MASSON染色的陽性染色面積百分比;取部分腎皮質(zhì)組織檢測VEGFA、TGF-β 1、COL-I蛋白表達(dá)水平和miR-200b基因表達(dá)水平。結(jié)果:(1)干預(yù)0周、4周、8周、12周時,與空白組比較,各組的體重均下降(P0.05);與模型組相比,理中湯組和氯沙坦鉀組的體重?zé)o顯著性改變(P0.05)。(2)干預(yù)12周后,與空白組比較,各組的腎臟重量指數(shù)顯著升高(P0.05);與模型組比較,理中湯組和氯沙坦鉀組的腎臟重量指數(shù)明顯降低(P0.05),但兩組間比較無明顯差異(P0.05)。(3)干預(yù)12周后,與空白組相比,各組的空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮、胰島素抵抗指數(shù)、糖化血紅蛋白和尿微量白蛋白均顯著升高(P0.05);與模型組相比,理中湯組能降低血糖、總膽固醇、甘油三酯、胰島素抵抗指數(shù)和糖化血紅蛋白(P0.05),而氯沙坦鉀組無顯著性改變(P0.05)。干預(yù)12周后,與模型組相比,理中湯組和氯沙坦鉀組均可以明顯降低肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白(P0.05),但兩組間比較無明顯差異(P0.05)。(4)干預(yù)12周后,染色和電鏡結(jié)果可見理中湯組和氯沙坦鉀組的病理變化較模型組明顯減輕;與模型組比較,理中湯組和氯沙坦鉀組PAS、PASM、MASSON染色陽性率均降低,有顯著性差異(P0.05)。(5)干預(yù)12周后,與空白組比較,各組的VEGFA、TGF-β 1、COL-I蛋白表達(dá)升高(P0.05);與模型組比較,理中湯組和氯沙坦鉀組的VEGFA、TGF-β 1、COL-I蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05),但理中湯組和氯沙坦鉀組兩組間比較無明顯差異(P0.05)。(6)干預(yù)12周后,與空白組比較,各組的miR-200b基因表達(dá)量明顯降低(P0.05);與模型組比較,理中湯組和氯氯沙坦鉀組miR-200b基因表達(dá)量明顯升高(P0.05),但是理中湯組和氯氯沙坦鉀組兩組間的miR-200b基因表達(dá)量無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:(1)理中湯可以改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝和腎功能;(2)理中湯可以改善2型糖尿病大鼠腎臟病理學(xué)變化,抑制纖維化進(jìn)展;(3)理中湯對2型糖尿病大鼠腎臟的抗纖維化作用可能與降糖、調(diào)節(jié)脂代謝和調(diào)控 TGF-β 1/miR-200b/VEGFA 通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖２大鼠腎臟組織的四種病理染色（Ｘ４００倍）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｆｏｕｒ邋Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｍｅｔｈｏｄｓ邋ｏｆ邋ｒｅｎａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｉｎ邋ｒａｔｓ逡逑注：Ａ邋組（Ａｌ、Ａ２、Ａ３、Ａ４）為空白組；Ｂ邋組（Ｂｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４）為模型組；Ｃ邋組（Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、逡逑Ｃ４）為氯沙坦鉀組；Ｄ組（Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）為理中湯組。Ａｌ、Ｂｌ、Ｃｌ、Ｄ１是ＨＥ染色；Ａ２、Ｂ２、逡逑Ｃ２、Ｄ２是ＰＡＳ染色，圖中陽性沉淀物為糖原，主要分布在腎小球系膜區(qū)內(nèi)，其顏色越深分布面積逡逑越廣提示腎小球系膜細(xì)胞增生越嚴(yán)重，系膜區(qū)越寬；Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３是ＰＡＳＭ染色，圖中黑色沉逡逑淀物為腎小球毛細(xì)血管和腎小管上的基膜，其顏色越深分布越寬廣說明基膜增厚越嚴(yán)重；Ａ４、Ｂ４、逡逑Ｃ４、Ｄ４是ＭＡＳＳＯＮ染色，圖中藍(lán)色物質(zhì)為膠原纖維，主要分布在腎小球和腎小管間質(zhì)間隙，其顏逡逑色越深分布越廣泛提示腎臟纖維化越嚴(yán)重。逡逑ｉｔ邋２０，邐＊邐Ｅ邐２０ｎ邐＊邐Ｊ邋３０，逡逑Ｉ邐Ｔ邐Ｉ邐Ｔ邐：逡逑ｊ１５－邐幽邐＊？邋＊．邐Ｉ１５＇邐＾邐ｌ２０．邐ｉ邐＊？逡逑ｔ：ｗｉｉ，邋ｉ：ｉｉｉｉ．，邋ｊ0ｍｉ，逡逑ＡＢＣＤ邐Ａ邐Ｂ邐Ｃ邐０邐＆邐Ａ邐Ｂ邐Ｃ邐Ｄ逡逑圖３邋ＰＡＳ染色、ＰＡＳＭ染色、ＭＡＳＳＯＮ染色陽性物質(zhì)容積分?jǐn)?shù)比較逡逑Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｖｏｌｕｍｅ邋ｆｒａｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＰＡＳ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ，邋ＰＡＳＭ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ａｎｄ邋ＭＡＳＳＯＮ逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｒａｔ邋ｇｌｏｍｅｒｕｌｉ逡逑注：圖Ａｌ、Ａ２為空白組；Ｂｌ、Ｂ２為模型組；Ｃｌ、Ｃ２為氯沙坦鉀組；Ｄｌ、Ｄ２為理中湯組。逡逑空白組邋模型組氯沙坦鉀組理中組逡逑０８－．逡逑0邋0４－邐１逡逑ｗ邋ｍｍｍ邋ｍｍｍ邋ｍｍ邐。。丨Ｈ逡逑＊逡逑＿Ｒ＿Ｍ？邋嶺邐痛＿邋ＴＧＦ－ｐｌ邐Ｂ邋＊？邋＊＇逡逑ｉ0，．邋，邋ｉ邋１逡逑ｏ逡逑ｆｌＨＨＰ邋４ＨＨｐ邐Ｔｕｂｕｌｉｎ逡逑

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