【摘要】：目的:卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中,易受培養(yǎng)環(huán)境的影響引發(fā)氧化應(yīng)激,導(dǎo)致其質(zhì)量下降。本課題組在前期研究證實補(bǔ)腎法能提高卵巢抗氧化能力、改善卵母細(xì)胞線粒體功能的基礎(chǔ)上,研究補(bǔ)腎法對體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞抗氧化能力的影響及其對ERK5-Keap1-Nrf2信號通路的調(diào)控作用,以期揭示補(bǔ)腎法提高體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞抗氧化能力的作用及機(jī)制,豐富中醫(yī)“腎主生殖”理論。方法:1.大鼠含藥血清的制備選用20只6周齡健康雌性SD大鼠,制備得補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清。2.小鼠卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)選用D24-26天的雌性昆明小鼠32只,將小鼠卵母細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常組、模型組、補(bǔ)腎組、NAC組。機(jī)械法分離卵巢,收集卵母細(xì)胞于37℃,5%CO_2,100%濕度的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)14h:倒置顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞PB1排出率,采用Oosight軟件觀測紡錘體形態(tài),采用MDA、SOD、GST試劑盒分別檢測卵母細(xì)胞MDA含量及SOD、GST活性。選用D24-26天的雌性昆明小鼠45只,將小鼠卵母細(xì)胞隨機(jī)分為5組:正常組、模型組、補(bǔ)腎組、NAC組、ERK5抑制劑組。卵母細(xì)胞收集及培養(yǎng)方法如上,培養(yǎng)6h:采用實時熒光定量PCR法檢測卵母細(xì)胞ERK5、Nrf2、Keap1 mRNA,檢測Nrf2下游抗氧化酶SOD、CAT mRNA表達(dá)。結(jié)果:1.各組卵母細(xì)胞PB1排出率的比較與正常組比較,模型組卵母細(xì)胞PB1排出率顯著降低(P0.01),補(bǔ)腎組、NAC組與正常組比較卵母細(xì)胞PB1排出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,補(bǔ)腎組、NAC組卵母細(xì)胞PB1排出率顯著增高(P0.01),NAC組與補(bǔ)腎組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.各組卵母細(xì)胞紡錘體形態(tài)的比較正常組卵母細(xì)胞具有正常的桶狀紡錘體形態(tài);模型組卵母細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了輕度皺縮或不規(guī)則改變,且觀測到不正常的狹長紡錘體;補(bǔ)腎組和NAC組具有正常的紡錘體形態(tài)。3.各組卵母細(xì)胞MDA含量,SOD活性及GST活性的比較MDA含量:與正常組比較,模型組MDA含量顯著升高(P0.01),補(bǔ)腎組、NAC組與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,NCA組MDA含量降低(P0.05),補(bǔ)腎組MDA含量顯著降低(P0.01);補(bǔ)腎組與NAC組之間MDA含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。SOD活性:與正常組對比,模型組SOD活性顯著降低(P0.01),補(bǔ)腎組、NAC組與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,補(bǔ)腎組、NAC組SOD含量顯著升高(P0.01),補(bǔ)腎組與NAC組之間SOD含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GST活性:與正常組對比,模型組GST含量顯著降低(P0.01),補(bǔ)腎組、NAC組與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,補(bǔ)腎組、NAC組GST含量升高(P0.05),補(bǔ)腎組與NAC組之間GST含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.各組卵母細(xì)胞ERK5、Keap1、Nrf2 mRNA表達(dá)比較ERK5 mRNA表達(dá):與正常組比較,模型組ERK5 mRNA表達(dá)升高(P0.05),補(bǔ)腎組、NAC組表達(dá)顯著升高(P0.01),抑制劑組與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組比較,補(bǔ)腎組、NAC組表達(dá)升高(P0.05),抑制劑組表達(dá)降低(P0.05);與抑制劑組比較,補(bǔ)腎組和NAC組表達(dá)均顯著升高(P0.01);補(bǔ)腎組與NAC組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Keap1 mRNA表達(dá):正常組、模型組、補(bǔ)腎組、NAC組及抑制劑組之間Keap1 mRNA表達(dá)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Nrf2 mRNA表達(dá):與正常組比較,模型組、補(bǔ)腎組、NAC組、抑制劑組表達(dá)顯著升高(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎組、NAC組表達(dá)顯著升高(P0.01),抑制劑組表達(dá)升高(P0.05);與補(bǔ)腎組、NAC組比較,抑制劑組表達(dá)降低(P0.05);補(bǔ)腎組與NAC組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.各組卵母細(xì)胞MnSOD、CAT mRNA表達(dá)比較Mn SOD mRNA統(tǒng)計結(jié)果:與正常組比較,補(bǔ)腎組、NAC組、抑制劑組表達(dá)顯著升高(P0.01),模型組升高(P0.05);與模型組比較,補(bǔ)腎組、NAC組表達(dá)顯著升高(P0.01),抑制劑組表達(dá)升高(P0.05);與補(bǔ)腎組、NAC組比較,抑制劑組表達(dá)降低(P0.05);補(bǔ)腎組與NAC組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。CAT mRNA統(tǒng)計結(jié)果:與正常組比較,模型組、抑制劑組、補(bǔ)腎組、NAC組CAT mRNA表達(dá)均顯著升高(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎組、NAC組CAT mRNA明顯升高(P0.01),抑制劑組與模型組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與補(bǔ)腎組、NAC組比較,抑制劑組表達(dá)降低(P0.05);補(bǔ)腎組與NAC組之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.在體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時添加H202會降低PB1排出率,影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中紡錘體的組裝,增加卵母細(xì)胞MDA的含量,降低抗氧化酶SOD、GST活性,造成卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。2.補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方及NAC可增加卵母細(xì)胞PB1排出率,改善紡錘體組裝,降低卵母細(xì)胞MDA含量,增加抗氧化酶SOD、GST活性,提高小鼠卵母細(xì)胞抗氧化能力,改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。3.在氧化應(yīng)激初期,H2O2、NAC、補(bǔ)腎法均可上調(diào)卵母細(xì)胞ERK5-Nrf2抗氧化應(yīng)激信號通路。4.補(bǔ)腎法改善體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用機(jī)制可能與其調(diào)控ERK5-Keap1-Nrf2抗氧化應(yīng)激通路相關(guān)。且補(bǔ)腎法提高卵母細(xì)胞抗氧化能力還可能存在其他蛋白激酶激活Nrf2通路的途徑。
【學(xué)位授予單位】：河北中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

河北中醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文各組卵母細(xì)胞 CAT m RNA 的表達(dá)：正常組為 1.54±0.42，模型±0.33，補(bǔ)腎組為 3.31±0.57；NAC 組為 3.41±0.44，抑制劑±0.36。（Table 4）與正常組比較，模型組、補(bǔ)腎組、NAC 組、抑制劑組表達(dá)均顯著0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎組、NAC 組 CAT mRNA 明顯升高），抑制劑組表達(dá)升高（P＜0.05）；與補(bǔ)腎組、NAC 組比較，表達(dá)降低（P＜0.05）；補(bǔ)腎組與 NAC 組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0g.10）附 圖

各組卵母細(xì)胞紡錘體形態(tài)的比較

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2722398