【摘要】：目的:本文以多種腫瘤細胞和小鼠H22肝癌移植瘤為實驗對象,研究鬼臼毒素衍生物P100的抗腫瘤作用,同時以K562細胞及多藥耐藥K562/A02細胞為實驗對象研究腫瘤多藥耐藥機制以及P100抗多藥耐藥的機制。方法:1通過MTT法檢測K562/A02細胞的多藥耐藥性及P100對多種腫瘤細胞的抑制效果。2建立小鼠H22肝癌移植瘤模型,通過尾靜脈一次注射P100(5,10,20mg/kg’weight)藥液評價體內(nèi)抗腫瘤作用。3通過Hoechst33342、PI染色法觀察P100誘導(dǎo)K562細胞及K562/A02細胞的凋亡形態(tài);DAPI染色法觀察P100誘導(dǎo)K562/A02細胞的凋亡形態(tài)。4流式細胞術(shù)檢測P100誘導(dǎo)K562細胞及K562/A02細胞凋亡的凋亡率5實時熒光定量PCR法檢測K562細胞及P100作用K562/A02細胞后PI3K基因、Akt基因、NF-κB基因、MDR-1基因、MRP基因、Caspase3基因、Caspase9基因mRNA表達的影響6 Western Blot法檢測K562細胞及P100作用K562/A02細胞后PI3K p110α蛋白、Akt1蛋白、Phospho-Akt1蛋白、IκBα蛋白、Phospho-IκBα蛋白、NF-κB p65蛋白、Phospho-NF-κB p65蛋白、P糖蛋白、Caspase3蛋白、Cleaved Caspase3蛋白、Caspase9蛋白、Cleaved Caspase9蛋白、Caspase8蛋白及Cleaved Caspase8蛋白表達的影響7通過RNAi技術(shù)干擾K562A/02細胞中MDR-1基因、NF-κB P65基因、Akt1基因的表達,檢測K562A/02細胞對阿霉素的耐藥性及相關(guān)蛋白表達的變化。結(jié)果:1 MTT法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)K562A/02細胞對多種作用機制不同的抗腫瘤藥物均有明顯耐藥性;P100對H4細胞、Hela細胞、A549細胞、MCF-7細胞、k562細胞、k562/a02細胞均有較好的抑制活性(ic50值范圍:0.06μmol/l~9.6μmol/l),而且抑制活性普遍高于陽性藥物vp-16,尤其對多藥耐藥細胞k562/a02,陽性對照藥vp-16的抑制效果較差(ic50值:21.83±4.78μmol/l),而p100能有效抑制k562a/02細胞生長(ic50值:4.90±0.86μmol/l)。另外,p100對人正常血管內(nèi)皮細胞926、心肌細胞h9c2均無明顯毒性。2小鼠h22移植瘤實驗結(jié)果顯示:不同濃度的p100(5,10,20mg/kg’weight)對小鼠肝癌移植瘤生長有明顯的抑制,抑制率分別達到31.3%、50.6%、70.0%。陽性對照藥vp-16(20mg/kg’weight)抑制率為51.3%。3hoechst33342、pi染色結(jié)果顯示k562細胞及k562a/02細胞形態(tài)完整,隨著不同濃度p100作用,細胞開始出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài),細胞發(fā)生皺縮、碎裂,有凋亡小體產(chǎn)生。隨藥物濃度增加凋亡越明顯;dapi染色結(jié)果顯示隨著不同濃度p100作用,k562/a02細胞開始皺縮,部分細胞胞核固縮。4流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同濃度的p100(1μmol/l、2μmol/l、4μmol/l)誘導(dǎo)k562細胞發(fā)生凋亡,凋亡比例分別為23.92±2.15%、54.37±4.97%、65.09±5.63%,vp-16(4μmol/l)組的凋亡比例為43.46±2.30%。p100(2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)誘導(dǎo)k562/a02細胞發(fā)生凋亡,凋亡比例分別為16.06±1.23%、27.29±3.36%、55.56±2.69%,陽性對照藥vp-16(10μmol/l)組的凋亡比例為21.08±3.76%�？梢妏100誘導(dǎo)k562及k562/a02細胞凋亡能的力明顯強于vp-16。5實時熒光定量pcr結(jié)果顯示k562a/02細胞比k562細胞中pi3k基因、akt1基因、nf-κb基因、mdr-1基因、mrp基因mrna表達升高,不同濃度p100(2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用后可下調(diào)k562a/02細胞pi3k基因、akt基因、nf-κb基因、mdr-1基因、mrp基因mrna表達,并上調(diào)caspase9基因、caspase3基因mrna表達。6westernblot檢測結(jié)果顯示k562a/02細胞比k562細胞中pi3kp110α蛋白、phospho-akt1蛋白、phospho-iκbα蛋白、nf-κbp65蛋白、phospho-nf-κbp65蛋白、p糖蛋白表達升高。不同濃度p100(2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用k562a/02細胞后,可下調(diào)pi3kp110α蛋白、Phospho-Akt1蛋白、Phospho-IκBα蛋白、NF-κB p65蛋白、Phospho-NF-κB p65蛋白、P糖蛋白及Caspase9蛋白、Caspase8蛋白、Caspase3蛋白表達,并上調(diào)Fas蛋白、Cleaved Caspase9蛋白、Cleaved Caspase8蛋白、Cleaved Caspase3蛋白表達。7轉(zhuǎn)染MDR-1 shRNA抑制了K562A/02細胞P糖蛋白表達,增強了細胞對阿霉素的敏感性,與shRNA對照組(NC)比較,IC50值由17.13±3.05μmol/L降至9.28±0.53μmol/L;轉(zhuǎn)染NF-κB p65 sh RNA抑制了K562A/02細胞Phospho-NF-κB P65蛋白的表達,并下調(diào)了P糖蛋白表達,細胞對阿霉素的敏感性增加,與shRNA對照組(NC)比較,IC50值由17.13±3.05μmol/L降至11.53±1.52μmol/L。轉(zhuǎn)染Akt1 siRNA抑制了K562A/02細胞中Akt1基因及Phospho-Akt1蛋白的表達,而細胞中P糖蛋白表達和細胞對阿霉素的敏感性無改變,但是降低了NF-κB基因的表達。結(jié)論:P100能抑制多種腫瘤細胞及多藥耐藥細胞的體外增殖,在體內(nèi)對小鼠H22肝癌移植瘤同樣有顯著的抑制作用,與陽性對照藥VP-16相比具有以下優(yōu)點:(1)具有良好的理化性質(zhì),水溶性較VP-16高100倍以上;(2)對正常細胞毒性較VP-16明顯降低,體外抗腫瘤活性和抗瘤譜優(yōu)于VP-16;(3)對多藥耐藥細胞K562/A02的活性較VP-16高近5倍。P100不僅可以誘導(dǎo)K562凋亡而且還可以誘導(dǎo)多藥耐藥細胞K562/A02發(fā)生明顯凋亡,相同劑量下VP-16僅能誘導(dǎo)K562凋亡而不能誘導(dǎo)K562/A02發(fā)生明顯凋亡。多藥耐藥細胞K562/A02與親本細胞K562之間在P糖蛋白及PI3K/Akt通路、NF-κB炎癥通路活化上有巨大差異,這提示耐藥表型P糖蛋白的表達與PI3K/Akt通路及NF-κB炎癥通路密切相關(guān)。而P100對多藥耐藥細胞K562A/02的作用機制可能與抑制PI3K/Akt通路、抑制NF-κB通路導(dǎo)致P糖蛋白下調(diào),另外啟動Fas凋亡途徑及Caspase級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)。這些結(jié)果說明P100在抗腫瘤多藥耐藥過程中通過多個靶點進行作用進而克服多藥耐藥。因此,P100作為一種新型化合物,對于抗腫瘤多藥耐藥類藥物的研究非常有價值。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

31圖 1 P100 對小鼠 H22 移植瘤及體重影響的結(jié)果Fig.1Effects of P100 on H22 transplanted tumor and weight in mousCompared with control,*P<0.05;**P<0.01

32 2 HE 染色觀察 P100 對小鼠 H22 移植瘤及臟器的影cts of P100 on H22 transplanted tumors and organs in mby hematoxylin-eosin staining. A: control (0.2 mL norma0 mg/kg weight); C: P100 (5 mg/kg weight); D: ight); E: P100 (20 mg/kg weight).

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7 王志光,莊武,尹述凡,馬維勇,李柄生,張椿年;4-酰硫基-4-脫氧-4-去甲表鬼臼毒素衍生物的合成和抗腫瘤活性[J];藥學(xué)學(xué)報;1992年05期

8 何峰;陸劍豪;謝志永;;抗癌藥鬼臼毒素衍生物的量子化學(xué)研究[J];中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)版);1999年04期

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10 馬維勇;李勇;王志光;尹述凡;張椿年;陳秀華;李炳生;;4-脫氧-4-磺酰胺基-4′-去甲表鬼臼毒素衍生物的合成和抗腫瘤活性研究[J];中國醫(yī)藥工業(yè)雜志;1993年05期

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本文編號：2720599