【摘要】：背景:目前,心力衰竭的治療已進(jìn)入平臺期,需要深入研究其發(fā)病機(jī)制,找出對應(yīng)的治療方法。心肌線粒體是心臟能量代謝的主要場所,其功能紊亂是導(dǎo)致心肌收縮功能障礙以致心力衰竭的重要因素。線粒體是一個高度動態(tài)的細(xì)胞器,通過不斷地生物合成、融合、分裂、線粒體自噬,使線粒體的形態(tài)、數(shù)量、質(zhì)量達(dá)到平衡狀態(tài),稱之為線粒體的質(zhì)量控制。線粒體的質(zhì)量控制是線粒體正常發(fā)揮其功能的基石,在心力衰竭的病理進(jìn)程中有重要作用。由于線粒體質(zhì)量控制是復(fù)雜的、多層次、多方面、相互影響的機(jī)制,這與中藥多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、網(wǎng)絡(luò)性的治療理念不謀而合,因此開展中藥治療心力衰竭心肌線粒體功能障礙的機(jī)制研究,可能為心力衰竭的治療提供新的思路和新的方向。目的:從線粒體的質(zhì)量控制方面切入,探索心復(fù)康口服液對心力衰竭大鼠心肌線粒體生物合成、線粒體動力學(xué)(融合/分裂)、線粒體自噬方面的影響,闡釋心復(fù)康口服液治療心力衰竭的藥理機(jī)制。方法:1.采用結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支的方法建立心肌梗死后心力衰竭模型;2.大鼠心功能的測定:所有大鼠分別于術(shù)前、術(shù)后及藥物治療8周后進(jìn)行超聲心動檢測,采用彩色多普勒超聲顯像儀測定左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs),計(jì)算出左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS);3.大鼠心肌形態(tài)學(xué)觀察:通過光學(xué)顯微鏡HE染色、Masson染色,對大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)及心肌纖維化進(jìn)行觀察,通過透射電子顯微鏡對大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察;4.采用qPCR、Western blot的方法對大鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)調(diào)控蛋白SIRT1/SIRT3與PGC-1a進(jìn)行檢測;5.采用Western blot的方法對大鼠心肌線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fis1、Mff進(jìn)行檢測;6.采用冰凍切片-免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測大鼠心肌線粒體自噬相關(guān)蛋白parkin、p62、LC3與線粒體內(nèi)膜標(biāo)記蛋白COXIV共定位的情況,用IPP圖像分析軟件進(jìn)行分析,用Pearson's correlation表示共定位的量,采用qPCR、Western blot的方法對大鼠心肌線粒體自噬相關(guān)蛋白pink1、parkin、p62、LC3進(jìn)行檢測。結(jié)果:1.心復(fù)康口服液對心力衰竭大鼠心功能的影響建立心梗后心力衰竭動物模型,藥物干預(yù)8周后,檢測各組大鼠心功能,分析數(shù)據(jù)得出:與假手術(shù)組相比,模型組LVIDd、LVIDs均增加,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),EF、FS均下降,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組LVIDd、LVIDs均有降低,其中,卡托普利組LVIDs降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),此外,與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組EF、FS均增加,其中卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組EF增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01,p0.05),卡托普利組FS增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(p0.05),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.心復(fù)康口服液對心力衰竭大鼠心肌組織病理結(jié)構(gòu)和心肌超微結(jié)構(gòu)的影響(1)各組HE染色觀察結(jié)果如下:假手術(shù)組:心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,結(jié)構(gòu)清晰,肌纖維排列整齊、致密,著色均勻。細(xì)胞核清晰,大小一致,未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組:心肌梗死灶范圍較大,心肌細(xì)胞顯著減少,梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞肥大。結(jié)構(gòu)模糊,肌纖維排列紊亂,出現(xiàn)肌絲溶解、斷裂。細(xì)胞核出現(xiàn)核碎裂、核溶解。大量炎性細(xì)胞浸潤�？ㄍ衅绽M、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組:心肌組織病變較模型組減輕,心肌細(xì)胞部分壞死,梗死灶范圍減小,心肌細(xì)胞肥大減輕。心肌纖維排列較疏松,細(xì)胞核大小不均勻,肌絲部分?jǐn)嗔?有部分炎性細(xì)胞浸潤。(2)各組Masson染色觀察結(jié)果如下:假手術(shù)組:心肌組織形態(tài)正常,心肌細(xì)胞排列整齊、緊密,細(xì)胞間隙有少量散在的膠原纖維。模型組:梗死區(qū)心肌細(xì)胞大量壞死,由膠原纖維代替。梗死邊緣區(qū),細(xì)胞排列松散,細(xì)胞間隙充滿大量膠原纖維。卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組:梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)膠原纖維較模型組明顯減少,心肌細(xì)胞排列較緊密,細(xì)胞間隙有較少的膠原纖維。(3)各組心肌超微結(jié)構(gòu)觀察如下:假手術(shù)組:心肌結(jié)構(gòu)良好,心肌纖維排列整齊,橫紋清晰,肌節(jié)完整,肌纖維間線粒體較多,線粒體形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,線粒體膜結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)部嵴清晰且排列緊密,未見腫脹、空泡,偶見自噬體。模型組:心肌結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,心肌纖維排列疏松、紊亂,走形不規(guī)則,出現(xiàn)斷裂。肌節(jié)欠完整,橫紋欠清晰,線粒體內(nèi)部嵴排列紊亂,膜結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)線粒體腫脹,自噬體明顯,空泡化明顯,線粒體數(shù)量減少�？ㄍ衅绽M、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組:心肌纖維排列較整齊,肌節(jié)尚規(guī)則,橫紋稍模糊,線粒體出現(xiàn)不同程度的腫脹、膜損傷,嵴排列較紊亂。線粒體周邊可見自噬相關(guān)單側(cè)膜結(jié)構(gòu)及髓樣體等。3.心復(fù)康口服液對心力衰竭大鼠心肌SIRT1/SIRT3、PGC-1α的影響通過對各組大鼠心肌組織中SIRT1/SIRT3、PGC-1α的mRNA含量檢測,分析數(shù)據(jù)得出:與假手術(shù)組相比,模型組SIRT1的mRNA水平明顯升高,SIRT3、PGC-1α的mRNA水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組SIRT1的mRNA水平均有不同程度的降低,其中卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組降低的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),此外,與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組SIRT3、PGC-1α的mRNA水平均有不同程度的升高,其中,心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組SIRT3的mRNA水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),心復(fù)康中劑量組PGC-1α的mRNA水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。通過對各組大鼠心肌組織中SIRT1/SIRT3、PGC-1α的蛋白相對表達(dá)量的檢測,分析數(shù)據(jù)得出:與假手術(shù)組相比,模型組SIRT1、SIRT3、PGC-1α的蛋白表達(dá)水平均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,p0.01,p0.01);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組SIRT1、SIRT3、PGC-1α的蛋白表達(dá)水平均有不同程度的升高,其中,卡托普利組SIRT1表達(dá)升高差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組SIRT3的蛋白表達(dá)水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),心復(fù)康大劑量組PGC-1α的蛋白表達(dá)水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.心復(fù)康口服液對心力衰竭大鼠心肌線粒體動力學(xué)的影響通過對各組大鼠心肌線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1相對表達(dá)量的檢測,分析數(shù)據(jù)得出:與假手術(shù)組相比,模型組Mfn1、Mfn2、Opa1的蛋白表達(dá)水平均明顯降低,差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組Mfn1、Mfn2、Opa1的蛋白表達(dá)水平均有不同程度的升高,其中,卡托普利組Mfn1表達(dá)升高差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組Mfn2的蛋白表達(dá)水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),卡托普利組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組Opa1的蛋白表達(dá)水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。通過對各組大鼠心肌線粒體融合相關(guān)蛋白Drp1、Fis1、Mff相對表達(dá)量的檢測,分析數(shù)據(jù)得出:與假手術(shù)組相比,模型組Drp1、Fis1、Mff的蛋白表達(dá)水平均明顯升高,差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01,p0.05,p0.01);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組Drp1、Fis1、Mff的蛋白表達(dá)水平均有不同程度的降低,其中,心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組Fis1的蛋白表達(dá)水平降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組Mff的蛋白表達(dá)水平降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,p0.01,p0.01,p0.05),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。5.心復(fù)康口服液對心力衰竭大鼠心肌線粒體自噬的影響(1)心肌線粒體自噬相關(guān)蛋白熒光共定位情況與假手術(shù)組相比,模型組parkin與COXⅣ共定位的量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組共定位的量均有降低,其中心復(fù)康大劑量組降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余各組降低差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與假手術(shù)組相比,模型組p62與COXⅣ共定位的量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組共定位的量均有降低趨勢,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與假手術(shù)組相比,模型組LC3與COX Ⅳ共定位的量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組共定位的量均有降低趨勢,其中,卡托普利組共定位的量略有降低,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組共定位的量均顯著降低,甚至略低于假手術(shù)組,且與模型組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,p0.05,p0.01)。(2)大鼠心肌組織中pink1、parkin、p62、L.C3mRNA及蛋白表達(dá)情況通過對各組大鼠心肌組織中pink1、parkin、p62、LC3的mRNA含量檢測,分析數(shù)據(jù)得出:與假手術(shù)組相比,模型組pink1的mRNA水平明顯降低,parkin、LC3的mRNA水平明顯升高,差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),p62的mRNA水平亦明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組pink1的mRNA水平均有不同程度升高,其中心復(fù)康小劑量組升高的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),此外,與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組parkin、p62、LC3的mRNA水平均有不同程度的降低,其中,卡托普利組parkin、LC3的mRNA水平降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,p0.01),心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組parkin、LC3的mRNA水平降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。通過對各組大鼠心肌組織中pink1、parkin、p62、LC3的蛋白相對表達(dá)量的檢測,分析數(shù)據(jù)得出:與假手術(shù)組比較,模型組pink1、parkin、p62蛋白表達(dá)水平降低,差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組的pink1、parkin、p62蛋白表達(dá)水平均有不同程度升高,其中,卡托普利組parkin、p62蛋白表達(dá)水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),心復(fù)康中劑量組parkin、p62蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01,p0.05),此外,與模型組相比,卡托普利組、心復(fù)康大劑量組、心復(fù)康中劑量組、心復(fù)康小劑量組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均有不同程度的降低,其中心復(fù)康中劑量組和心復(fù)康小劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低較明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.心復(fù)康口服液及卡托普利能夠降低心力衰竭大鼠的LVIDd、LVIDs,升高EF、FS,進(jìn)而抑制心力衰竭大鼠左室重構(gòu),增強(qiáng)心臟泵血功能。2.心復(fù)康口服液及卡托普利能夠減輕心力衰竭大鼠心肌病理結(jié)構(gòu)損傷及心肌纖維化,對心肌超微結(jié)構(gòu)有明顯的改善作用。3.心復(fù)康口服液及卡托普利能明顯上調(diào)SIRT1、PGC-1α、SIRT3的表達(dá),進(jìn)而減輕心力衰竭大鼠心肌線粒體生物合成功能的損傷,起到促進(jìn)心肌能量代謝的作用。4.心復(fù)康口服液及卡托普利通過上調(diào)線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1,下調(diào)線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1、Mff,促進(jìn)線粒體融合,抑制線粒體分裂,起到調(diào)控心力衰竭大鼠心肌線粒體動力學(xué),恢復(fù)線粒體動力學(xué)平衡狀態(tài)的作用。5.心復(fù)康口服液及卡托普利可以通過pink1/parkin通路抑制心力衰竭大鼠心肌線粒體自噬過度的狀態(tài)。6.心復(fù)康口服液及卡托普利可以通過調(diào)控線粒體生物合成、線粒體動力學(xué)、線粒體自噬,影響心力衰竭大鼠心肌的線粒體質(zhì)量控制,起到促進(jìn)心肌能量代謝,改善心功能的作用。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖２各組ＨＥ染色圖逡逑

圖３各組Ｍａｓｓｏｎ染色圖逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2718629