【摘要】：目的:通過觀察養(yǎng)胃解毒合劑聯(lián)合泰能對膿毒癥模型大鼠腸黏膜的保護作用,并且圍繞炎癥、細胞凋亡以及腸黏膜屏障等指標,來探討?zhàn)B胃解毒合劑保護腸粘膜防治膿毒癥的作用機制。材料與方法:將140只大鼠隨機分為7組:正常組20只、模型組20只、中藥正常劑量組20只、中藥高劑量(2倍)組20只、西藥組(泰能)20只、西藥+中藥正常劑量組20只、西藥+中藥高劑量組20只。采用盲腸末端結(jié)扎并穿孔的手術(shù)方式復制膿毒癥大鼠模型,按每kg體重大鼠的給藥量為人的6.3倍計算,給予各組大鼠不同因素干預:正常組:予以生理鹽水按照每100g體重1ml的劑量灌胃;模型組:模型復制成功后,予以生理鹽水每100g體重1ml的劑量灌胃;中藥正常劑量組:模型復制后,按每100g體重1ml劑量給予正常劑量中藥(1ml藥液含生藥量1.4g,下同)灌胃;中藥高劑量組:模型復制后,按每100g體重1ml劑量給予高劑量中藥(1ml藥液含生藥量2.8g,下同)灌胃;西藥組:模型復制后,泰能100mg每kg體重劑量日2次腹腔注射給藥;西藥+中藥正常劑量組:模型復制后,泰能100mg每kg體重劑量日2次腹腔注射給藥+正常劑量中藥每100g體重1ml劑量灌胃;西藥+中藥高劑量組:模型復制后,泰能100mg每kg體重日2次腹腔注射給藥+高劑量中藥每100g體重1ml劑量灌胃。灌胃予以日2次,連續(xù)給藥2天后,統(tǒng)計各組大鼠的死亡率,采集血清、回腸組織樣本,檢測各項指標。實驗一:酶聯(lián)免疫吸附測定方法(ELISA)檢測各組大鼠血清標本TNF-α、IL-1β含量;觀察回腸標本外觀形態(tài)、觀察各組大鼠回腸組織HE染色。實驗二:酶聯(lián)免疫吸附測定方法(ELISA)檢測各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1β含量。實時定量熒光PCR(Real-time PCR)法檢測各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1βm RNA表達。免疫印跡法(Western blot)檢測腸組織炎癥通路TLR2/4、NF-κB蛋白表達,檢測凋亡相關因子Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達。實驗三:免疫組織化學法(IHC)檢測大鼠腸組織Occludin、Claudin-1和ZO-1表達及分布;實時定量熒光PCR(Real-time PCR)法檢測各組大鼠腸組織中occludin,Claudin-1,ZO-1 m RNA表達;免疫印跡法(Western blotting)檢測各組大鼠腸組織中Occludin,Claudin-1,ZO-1等蛋白的表達。結(jié)果:1.各組大鼠一般狀態(tài)、生存率及回腸組織形態(tài)學改變1.1大鼠一般狀態(tài)的變化正常組大鼠外表皮毛顏色、精神狀態(tài)、反應靈敏度、活動狀態(tài)、行為、攝食量、飲水量、大便排出方面均正常,體重增加較快;與正常組比較,模型組大鼠毛色干枯蓬松欠光滑易脫毛,精神萎靡,應激能力差,活動減少,拱背蜷縮,喜歡蜷縮在一起,進食量減少,手術(shù)傷口愈合度差,大便稀,有大鼠目色紅;與模型組比較,中藥正常劑量組及中藥高劑量組大鼠毛色略有干枯,精神輕度萎靡,反應及活動尚可,時有蜷縮,進食及飲水量均比模型組增加,手術(shù)傷口愈合度尚可,大便質(zhì)略稀,有大鼠目色紅;與模型組比較,西藥組及西藥+中藥正常劑量組有部分大鼠毛色略有干枯,精神輕度萎靡,反應及活動尚可,時有蜷縮,進食及飲水量均比模型組增加,手術(shù)傷口基本愈合,大便質(zhì)略稀,有大鼠目色紅;與模型組比較,西藥+中藥高劑量組大鼠毛色略有干枯,無精神萎靡,反應及活動基本正常,偶有蜷縮,進食及飲水量均比模型組增加,手術(shù)傷口愈合,大便質(zhì)略稀,無大鼠目色紅現(xiàn)象。1.2大鼠死亡率的變化正常組大鼠無死亡,死亡率為0;模型組大鼠死亡12只,死亡率為60%;中藥正常劑量組共死亡大鼠11只,死亡率為55%;中藥高劑量(2倍)組死亡大鼠11只,死亡率為55%、西藥組(泰能)大鼠死亡10只,死亡率為50%、西藥+中藥正常劑量組大鼠死亡11只,死亡率為55%、西藥+中藥高劑量組大鼠死亡8只,死亡率為40%。1.3大鼠回腸組織形態(tài)學變化HE染色顯示:正常組小腸上皮腸細胞形態(tài)正常,模型組小腸上皮組織水腫嚴重,大量炎癥細胞浸潤,能夠見到大量壞死脫落的上皮細胞。中藥正常劑量組、中藥高劑量組、西藥組、西藥+中藥正常劑量組和西藥+中藥高劑量組炎癥細胞減少,水腫程度減輕,未見壞死脫落的上皮細胞,其中以中藥高劑量組與西藥+中藥高劑量組尤為明顯。2.各組大鼠腸組織TLR2、4-NF-κB炎癥信號通路及調(diào)控相關因子的變化2.1各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1β變化2.1.1各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1β含量的變化與正常組對比,模型組中大鼠腸組織TNF-α、IL-1β含量顯著增高,具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型組相比,西藥組、西藥+中藥高劑量組大鼠腸組織TNF-α水平均顯著下降(P0.01),各治療組大鼠腸組織IL-1β水平均顯著降低(P0.01);與西藥組相比,西藥+中藥高劑量組大鼠腸組織TNF-α水平均顯著下降(P0.01),西藥+中藥高劑量組和西藥+中藥高正常劑量組大鼠腸組織IL-1β水平均顯著下降(P0.01)。2.1.2各組大鼠腸組織TNF-α、IL-1βm RNA表達的變化與正常組相比,模型組大鼠小腸組織TNF-α、IL-1βm RNA表達水平顯著增高,具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型組相比,各干預組大鼠腸組織TNF-αm RNA表達水平均顯著下降(P0.01),西藥組和西藥+中藥高劑量組大鼠腸組織IL-1βm RNA表達水平均顯著下降(P0.01);與西藥組相比,西藥+中藥高劑量組大鼠腸組織TNF-α、IL-1βm RNA表達水平均下降,但無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.2大鼠腸組織TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表達的變化與正常組相比,模型組大鼠腸組織TLR2蛋白水平顯著升高(P0.01),TLR4、NF-κB水平升高(P0.05);與模型組相比,除中藥正常劑量組腸組織NF-κB表達無影響外,其余各干預組大鼠腸組織TLR2、TLR4和NF-κB蛋白表達水平均下降(P0.05);與西藥組相比,西藥+中藥高劑量組、中藥正常劑量組和西藥+中藥正常劑量組大鼠腸組織TLR2蛋白表達水平均下降(P0.05),西藥+中藥高劑量組NF-κB蛋白表達水平均下降(P0.05)。3.各組大鼠腸組織凋亡因子的變化與正常組相比,模型組中大鼠腸組織Bax和Capase3蛋白表達顯著增高,Bcl-2蛋白表達顯著降低,具有統(tǒng)計學意義(P0.01);與模型組相比,西藥+中藥高劑量組大鼠腸組織Bax和Capase3水平均顯著降低,Bcl-2表達顯著增高(P0.01);與西藥組相比,西藥+養(yǎng)胃解毒合劑高劑量組大鼠腸組織Bax和Caspase3蛋白表達均顯著降低,Bcl-2蛋白表達顯著增高(P0.01)。4.各組大鼠腸黏膜屏障相關蛋白的變化4.1 IHC法檢測大鼠腸黏膜屏障相關蛋白表達及分布4.1.1 IHC法檢測大鼠腸黏膜屏障相關蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1表達及分布光鏡下顯示:正常組Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白在腸細胞膜周圍可見大量棕黃色的陽性顆粒表達,排列有序;與正常組比較,模型組可見棕黃色的陽性顆粒表達減少,排列相對無序;與模型組相比較,各治療組均可見棕黃色的陽性顆粒表達,數(shù)量上有明顯增加,排列有序,西藥加中藥高劑量組尤為明顯。4.1.2各組大鼠免疫組化平均灰度的表達變化Occludin:各組圖像分析積分光密度:與正常組相比較,模型組積分光密度顯著降低(P0.01);與模型組比較,西藥組、西藥加中藥高劑量和西藥加中藥正常劑量組積分光密度顯著升高(P0.01);與西藥組比較,西藥加中藥高劑量和西藥加中藥正常劑量組積分光密度明顯升高(P0.01)。Claudin-1:各組圖像分析積分光密度:與正常組相比較,模型組積分光密度顯著降低(P0.01);與模型組比較,各干預組積分光密度顯著增高(P0.01),中藥正常劑量組除外;與西藥組比較,西藥加中藥高劑量和西藥加中藥正常劑量組積分光密度明顯下降(P0.01)。ZO-1:各組圖像分析積分光密度:與正常組相比較,模型組積分光密度顯著降低(P0.01);與模型組比較,五個治療組積分光密度均顯著升高(P0.01)。4.2各組大鼠腸屏障功能相關m RNA表達的變化與正常組比較,模型組Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA表達水平顯著下調(diào)(P0.01);與模型組相比,西藥組、中藥高劑量組、西藥+中藥正常劑量組和西藥+中藥高劑量組Occludin、Claudin-1和ZO-1 m RNA表達顯著升高(P0.01),其中以西藥+中藥高劑量組變化最顯著,中藥正常劑量組無顯著改變;與西藥組相比較,西藥組+中藥高劑量組Occludin基因m RNA表達有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義,Claudin-1和ZO-1m RNA表達水平顯著升高(P0.01),中藥正常劑量組Occludin m RNA表達水平顯著下降(P0.05)。4.3對各組大鼠回腸屏障功能相關蛋白表達的影響與正常組比較,模型組Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表達水平顯著下調(diào)(P0.01),與模型組相比,各治療組Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白表達顯著升高(p0.01),其中以西藥+中藥高劑量組變化最為顯著,且中藥高劑量組變化顯較中藥正常劑量組變化更為顯著。與西藥組比較,中藥高劑量組與中藥正常劑量組Claudin-1顯著降低(P0.01),中藥正常劑量組ZO-1顯著降低(P0.01),西藥+中藥高劑量組Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白表達顯著升高(P0.01),西藥+中藥正常劑量組Occludin和ZO-1蛋白表達顯著升高(P0.01)。結(jié)論:1.養(yǎng)胃解毒合劑聯(lián)合泰能對膿毒癥模型大鼠的腸粘膜有明顯的保護作用,其中以中藥高劑量組為優(yōu),養(yǎng)胃解毒合劑高劑量聯(lián)合泰能能起到協(xié)同作用。2.養(yǎng)胃解毒合劑通過下調(diào)膿毒癥模型大鼠炎癥因子減輕其炎癥反應。3.養(yǎng)胃解毒合劑通過調(diào)控膿毒癥模型大鼠相關凋亡因子減少腸上皮細胞的凋亡。4.養(yǎng)胃解毒合劑通過上調(diào)膿毒癥模型大鼠腸粘膜屏障相關蛋白的表達來保護腸黏膜。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1.制備膿毒癥大鼠模型手術(shù)流程圖2.2.2 干預方法于手術(shù)后 4 小時后進行用藥，連續(xù)給藥 2 天，①正常組：按每只 2ml/次的胃給予生理鹽水，每日 2 次；②模型對照組：模型復制后，按每只 2ml/次的劑給予生理鹽水，每日 2 次；③中藥正常劑量組：模型復制后，給予正常劑量養(yǎng)胃劑 1ml/100g 灌胃，日 2 次灌胃；④中藥高劑量組：模型復制后，給予高劑量養(yǎng)合劑 1ml/100g 灌胃，日 2 次灌胃；⑤西藥組：模型復制后，給予泰能 100mg/(k次腹腔注射；⑥西藥+中藥正常劑量組：模型復制后，給予泰能 100mg/(kg.d)日 注射，給予正常劑量養(yǎng)胃解毒煎劑 1ml/100g 灌胃，日 2 次灌胃；⑦西藥+中藥高模型復制后，給予泰能 100mg/(kg.d)日 2 次腹腔注射，給予高劑量養(yǎng)胃解毒煎劑 1灌胃，日 2 次灌胃。給藥結(jié)束后，其中正常組死亡率 0、模型組死亡 12 只、中藥量組死亡率 11 只、中藥高劑量組死亡率 11 只、西藥組（泰能）死亡 10 只、西正常劑量組死亡 11 只、西藥+中藥高劑量組死亡 8 只。

圖 2.模型組大鼠腹腔解剖圖察各組大鼠小腸病理變化，方法如下：本腸組織，置于 10%福爾馬林里進行固定。酒精進行脫水，濃度按順序從 50%、70%、，每級酒精的脫水時間大概為 30 分鐘。苯透明，然后再二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明 20 分予以切片，組織的切片厚度應為 5 微米。片沒入二甲苯Ⅰ，20 分鐘后洗去石蠟。標精 5 分鐘，然后洗去二甲苯。無水酒精Ⅱ%、50%酒精中各浸入 5 分鐘。蘇木精溶液染色 3 分鐘，然后用清水清洗應該上色（如細胞質(zhì)）部分。用自來水沖

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本文編號：2718500