【摘要】：苦參為我國傳統(tǒng)中藥材之一,收錄于《本草綱目》草部第十三卷,來源于豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根,苦、寒、無毒,具有清熱燥濕、殺蟲利尿的功效,臨床多與其他藥物配伍治療熱痢便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹濕瘡、皮膚瘙癢、疥癬麻風(fēng)等,體現(xiàn)了獨(dú)特的抗氧化、抑菌及抗炎等藥理作用,其抗氧化活性成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。研究表明,生物堿和黃酮類化合物是苦參中主要的兩大類化學(xué)成分。目前的國家藥典是以苦參堿(matrine)和氧化苦參堿(oxymatrine)作為其定性和定量指標(biāo);另外,藥典對臨床功效明顯不同的山豆根也同樣以這兩種生物堿作為定性和定量指標(biāo)。這表明僅以生物堿來評價苦參的整體質(zhì)量和藥效尚不完善,苦參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),苦參中黃酮類化合物HPLC指紋圖譜可有效區(qū)分苦參和山豆根,提示苦參黃酮成分具有較高的專屬性。然而目前對苦參專屬代表性黃酮成分的分離、提純等研究較少,市場所售苦參黃酮標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量參差不齊且價格較高。如何結(jié)合黃酮類化合物抗氧化特性,建立一種更為高效的分離方法是研究苦參黃酮類化合物的關(guān)鍵;同時對苦參黃酮抑菌及抗炎活性的評價有助于完善其對苦參傳統(tǒng)功效的貢獻(xiàn)。基于以上,本論文擬結(jié)合TLC-DPPH、柱層析、重結(jié)晶等方法分離苦參中的主要黃酮成分,并通過NMR、UPLC-Q-TOF-MS、HPLC-DAD等技術(shù),建立快速分離苦參黃酮的導(dǎo)向分離及檢測方法;采用體外抑菌及體內(nèi)外抗炎實(shí)驗(yàn),初步評價苦參總黃酮及黃酮類化合物的生物活性。一、基于TLC-DPPH導(dǎo)向跟蹤分離的苦參黃酮類化合物的化學(xué)成分研究建立了基于TLC-DPPH快速篩選苦參藥材抗氧化活性成分的方法,并比較了不同產(chǎn)地苦參抗氧化活性的強(qiáng)弱。采用95%乙醇對苦參藥材進(jìn)行熱回流提取,再結(jié)合硅藻土-乙酸乙酯法富集得到苦參黃酮部位,并采用TLC-DPPH導(dǎo)向跟蹤及各種柱層析方法,建立了苦參中具有抗氧化活性黃酮類化合物的分離方法,成功制備得到12個具抗氧化活性的苦參單體化合物,其中11個化合物經(jīng)MS和NMR鑒定為:trifolirhizin、nor-anhydroicaritin、calycosin、isoxanthohumol、trifohrhizin-6′-monoacetate、kurarinone、sophoraflavanone G、maackiain、formononetin、8-lavandulyl-5,7,4′-trihydroxy-flavonol、5-methyl-kushenol C。另,KS-12的結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步確定。其中制備得到苦參中的代表性黃酮化合物kurarinone、sophoraflavanone G的純品量均達(dá)到2 g以上。比較了上述11個單體的抗氧化活性強(qiáng)弱,LODs結(jié)果如下:5-methyl-kushenol C(0.06 mM)kurarinone、sophoraflavanone G(0.06 mM)calycosin、isoxanthohumol(0.06 mM)8-lavandulyl-5,7,4′-trihydroxy-flavonol、trifohrhizin-6′-monoacetate、maackiain(0.12mM)nor-anhydroicaritin、formononetin(0.25 mM)trifolirhizin(0.5 mM)。采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù),建立了定性評價苦參中黃酮類成分的方法,并采用HPLC-DAD,建立了定量測定苦參提取物中kurarinone和sophoraflavanone G的方法。二、苦參黃酮類化合物的體外抑菌活性研究采用微量稀釋法測MIC值,評價苦參生物堿部位(SA)和苦參黃酮部位(SF)對不同細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果顯示:SF對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別是1 mg/mL和0.25 mg/mL;SA的分別是32 mg/mL和8 mg/mL。采用直接TLC-生物自顯影-MTT法測LOD值,評價苦參生物堿和黃酮單體對不同細(xì)菌LOD值的影響。結(jié)果顯示:matrine和oxymatrine對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的LOD值均大于4 mM;kurarinone、sophoraflavanone G和5-methyl-kushenol C對金黃色葡萄球菌的LOD值為0.5~1 mM,對大腸埃希菌的LOD值均小于0.5mM。采用紙片擴(kuò)散法測抑菌圈,評價苦參黃酮單體對不同細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果顯示:sophoraflavanone G對受試菌種均有不同程度的抑制作用;kurarinone和maackiain只對革蘭氏陽性菌有抑制作用;trifolirhizin對受試菌種均無抑制作用;所選黃酮單體對銅綠假單胞菌均無抑制作用。三、苦參黃酮類化合物的體內(nèi)外抗炎活性研究以二甲苯致耳廓腫脹小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,評價SA和SF體內(nèi)抗炎效果。結(jié)果顯示:與空白對照組比較,SA低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)和SF低劑量組差異不顯著(P0.05);SA高劑量組(200 mg/kg)、SF中劑量組和高劑量組極顯著抑制二甲苯致炎小鼠耳廓的腫脹(P0.01),其中SF高劑量組抑制效果最好,抑制率達(dá)41.2%。以冰醋酸致腹腔毛細(xì)血管通透性增高小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,評價SA和SF體內(nèi)抗炎效果。結(jié)果顯示:與空白對照組比較,SA低劑量組、中劑量組和SF低劑量組差異不顯著(P0.05);SF中劑量組有顯著差異(P0.05);SA和SF高劑量組有極顯著差異(P0.01),其通透性增強(qiáng)抑制率分別為39.9%和50.2%。以角叉菜膠致足腫脹小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,評價SA和SF體內(nèi)抗炎效果。結(jié)果顯示:與空白對照組比較,SA和SF低劑量組致炎后1、2、4、6 h均無顯著性差異(P0.05);SA和SF中劑量組致炎后1 h和2 h無顯著性差異(P0.05),但4 h和6 h有極顯著差異(P0.01),致炎6 h后抑制率分別是52.8%和59.4%;SA和SF高劑量組致炎后1、2、4、6 h都有極顯著抑制足跖腫脹的作用(P0.01),致炎6 h后抑制率分別是74.4%和72.0%。且PGE_2檢測結(jié)果表明,與吲哚美辛組比較,SA和SF高劑量組有極顯著差異(P0.01)。以LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,評價SF和SA體外抗炎效果。結(jié)果顯示:SF和SA濃度≤100μg/mL時,對細(xì)胞無毒性作用(P0.05)。與LPS模型組比較,不同濃度SF藥液均呈劑量依賴性抑制NO、TNF-α、IL-6和MCP-1的釋放(P0.01);不同濃度SA藥液不呈劑量依賴性抑制各炎癥因子的釋放(P0.05或P0.01)。與SA組比較,SF高劑量組明顯抑制各炎癥因子的釋放(P0.01),表明SF具有顯著的抗炎作用。綜合以上,本文結(jié)合TLC-DPPH、柱層析、重結(jié)晶等方法分離單體成分,并通過NMR、UPLC-Q-TOF-MS、HPLC-DAD等技術(shù),建立了快速分離苦參黃酮的導(dǎo)向分離及檢測方法;采用體外抑菌及體內(nèi)外抗炎實(shí)驗(yàn),明確了苦參黃酮對苦參傳統(tǒng)功效的貢獻(xiàn)。這為苦參黃酮類成分作為苦參質(zhì)量及藥效評價的指標(biāo)奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),并為合理開發(fā)和利用苦參資源提供了新的科學(xué)依據(jù)。本論文的創(chuàng)新之處:1、建立TLC-DPPH導(dǎo)向跟蹤分離苦參黃酮的新方法;2、采用體外抑菌和體內(nèi)外抗炎方法初步評價了苦參黃酮的生物學(xué)活性,并與苦參生物堿的相關(guān)活性進(jìn)行比較,初步證實(shí)苦參黃酮對苦參傳統(tǒng)功效的貢獻(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284.1
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文不同產(chǎn)地苦參抗氧化活性成分的篩選結(jié)果LC-DPPH 方法篩選不同產(chǎn)地苦參提取物中抗氧化成分的結(jié)果，如圖 1-1-1 可知，不同產(chǎn)地苦參提取物產(chǎn)生的抗氧化活性斑點(diǎn)的 Rf值基本一致，要集中于 Rf=0.1 到 Rf=0.8 之間，其中斑點(diǎn) C、D、H 是穩(wěn)定存在的抗，可判斷不同產(chǎn)地苦參具有相同的主要抗氧化活性成分。

用 8 倍量 95 %乙醇 80℃提取 3 h，濾過，回收溶劑，得含醇量 10 %以下苦參流干，用 8 倍量乙酸乙酯超聲提取 2 h，抽并，回收溶劑，蒸干，稱重，得苦參 Et酮溶解，加適量 100-200 目柱層析硅膠拌析硅膠，干法裝柱，先輕輕掂柱，然后抽法上樣，同法排氣泡 1 h，再加入保護(hù)硅酯 甲醇（5:5:1，v/v/v），下口收集 1000條帶顏色劃分成 24 個小組分并掏柱、晾新合并分類，并用甲醇洗脫，收集流分，分 F10-24 富含抗氧化活性成分。根據(jù)顯Fr 10-17、Fr 18-19、Fr 20-24），各流分具

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2718355