【摘要】：研究目標:非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精外,由其他明確的損肝因素所致的,以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。它是很多慢性重型肝臟疾病,如肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)的重要原因之一。NAFLD與活性氧(ROS)自由基產(chǎn)生和氧化還原平衡的破壞相關。Bmi1蛋白是聚刷蛋白抑制復合物1(polycomb repressor complex 1,PRC1)的組分之一,其主要功能是在組織發(fā)育和細胞分化、增殖中調控發(fā)育和增殖相關基因表達。Bmi1蛋白在介導ROS的生成、線粒體的功能與DNA損傷修復(DNA damage repair,DDR)中扮演重要作用。研究顯示天然植物性抗氧化劑,白藜蘆醇可以保護肝組織免受氧化應激和肝線粒體功能障礙的損傷。本研究中,我們通過油酸誘導的L02細胞NAFLD模型,以及向L02細胞中轉染過表達和降低Bmi1的質粒的方法,采用Western blot、qRT-PCR和免疫熒光技術,評價白藜蘆醇是否是通過上調氧化相關蛋白Bmi1的表達,降低ROS從而起到緩解油酸誘導的脂毒性作用。研究方法:本研究首先查看研究所給予的白藜蘆醇劑量是否可以緩解油酸誘導的L02細胞脂肪積累、代謝損傷和凋亡毒性作用。然后查看實驗中的白藜蘆醇是否可以降低油酸誘導的L02細胞氧化應激能力,以及改善DNA損傷。再用Western blot和qRT-PCR的方法確定目標分子Bmi1是否是白藜蘆醇的作用靶點。最后,在L02細胞中過表達和降低Bmi1的表達水平,查看油酸對L02細胞的脂毒性作用,從而證明給予白藜蘆醇起著和上調Bmi1一樣的保護作用。研究結果:白藜蘆醇改善了油酸誘導的L02細胞脂毒性作用,并且白藜蘆醇降低了油酸誘導的L02細胞積累的ROS水平;同時,油酸誘導的L02細胞中,Bmi1蛋白表達降低且其下游通路蛋白INK4A/ARF上調,而白藜蘆醇上調了Bmi1蛋白卻降低INK4A/ARF。此外,向L02細胞中轉染Bmi1 siRNA后,細胞更容易造成脂毒性;而向L02細胞中轉染過表達Bmi1質粒,可以拮抗油酸誘導的脂毒性損傷。這些發(fā)現(xiàn)不僅闡明了白藜蘆醇作為抗氧化劑緩解NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機制,也為開發(fā)白藜蘆醇作為防治NAFLD的藥物提供了理論支持。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文降（圖 1.C）。油酸處理后，L02 細胞中促進凋亡蛋白 cleaved caspase3 和 Bax 蛋白表達顯著上升，抑制凋亡蛋白 Bcl2 蛋白表達顯著下降，而油酸與白藜蘆醇聯(lián)合給藥時，凋亡相關基因表達情況都被逆轉（圖 1.D）。這所有的結果都顯示，白藜蘆醇改善了油酸誘導的 L02 細胞凋亡。

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文（0.8 mM）或聯(lián)合白藜蘆醇（50 uM）培養(yǎng) 24 h 后，Western blot 顯示凋亡相關蛋白的表達水平。3.2 白藜蘆醇改善了油酸誘導的 L02 細胞脂滴積累Joseph A. Baur 在 2006 年首次報道白藜蘆醇降低了肥胖小鼠的脂滴積累，隨后大量的研究證實了白藜蘆醇能改善肝臟脂肪化，因而我們應用油酸模型驗證白藜蘆醇對脂滴形成的作用。我們發(fā)現(xiàn)，用 0.8 mM 油酸處理 L02 細胞 24 h 后，油紅 O 染色結果顯示，細胞脂滴積累明顯增多（圖 2.A）。而當將白藜蘆醇和油酸聯(lián)合給藥時，因油酸而積累的脂滴數(shù)量明顯降低（圖 2.A）。同時，我們應用TG 定量試劑盒檢測了細胞內的脂滴濃度，發(fā)現(xiàn)油酸處理組 TG 濃度顯著升高，而白藜蘆醇和油酸聯(lián)合組 TG 濃度較油酸處理組顯著降低（圖 2.B）。**: p < 0.01表示組間有顯著性差異。

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本文編號：2718291