【摘要】：背景及目的:骨骼是進(jìn)展期惡性腫瘤常見的轉(zhuǎn)移部位,其中80%是由乳腺癌、前列腺癌和肺癌引起的。腫瘤轉(zhuǎn)移至骨通過釋放一系列因子激活破骨細(xì)胞,吸收骨基質(zhì),造成溶骨性病變,繼而引起病理性骨折、高鈣血癥、難以忍受的骨痛和神經(jīng)壓迫癥狀等一系列的骨骼相關(guān)事件。破骨細(xì)胞起源于骨髓單核-巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞,是體內(nèi)唯一負(fù)責(zé)吸收骨質(zhì)的細(xì)胞,正常情況下與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成,維持動態(tài)平衡。在一些刺激因素存在下,破骨細(xì)胞過度激活,將引起一系列骨破壞相關(guān)疾病。在一些腫瘤細(xì)胞引起的骨破壞中發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞處于過度激活狀態(tài)。因此,靶向破骨細(xì)胞的藥物可以有效緩解腫瘤細(xì)胞引起的骨破壞,并且提高患者的生活質(zhì)量和改善預(yù)后。目前臨床上用于預(yù)防和治療骨轉(zhuǎn)移事件的代表性藥物有雙膦酸鹽類的唑來膦酸和生物制劑denosumab單抗,這些藥物都是針對破骨細(xì)胞的。但是,近來研究發(fā)現(xiàn)長期服用雙磷酸鹽類藥物會抑制骨組織的自然更新,能夠引起非脊柱骨折患者骨折愈合延遲,同時也會增加股骨干骨折的風(fēng)險。Denosumab為完全的人單克隆抗體,由安進(jìn)(Amgen)公司生產(chǎn),2010年11月獲美國FDA批準(zhǔn)用于實(shí)體瘤骨轉(zhuǎn)移患者預(yù)防骨骼相關(guān)事件的發(fā)生;通過抑制核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的活性,而抑制破骨細(xì)胞生成引起的骨破壞和骨吸收。但其需要皮下注射,價格亦昂貴,而且存在下頜骨壞死等嚴(yán)重并發(fā)癥。因此急需繼續(xù)研究服用方便,安全有效的預(yù)防和治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)事件藥物。青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的單體藥物,具有顯著的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎作用,臨床上廣泛用于治療風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。近年來,隨著對青藤堿研究的深入,其在抗腫瘤方面的作用也愈來愈受到國內(nèi)外學(xué)者重視,有研究發(fā)現(xiàn)青藤堿對乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌等多種腫瘤都有較好的抑制作用。與目前臨床用藥唑來膦酸和denosumab相比,青藤堿在鎮(zhèn)痛方面的優(yōu)勢突出。此外,唑來膦酸常伴有流感樣癥狀(發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、肌痛、一過性骨痛)的不良反應(yīng),有研究發(fā)現(xiàn)用選擇性環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑塞來昔布等可以緩解以上不良癥狀,而青藤堿作為選擇性COX-2抑制劑的一種,亦可以用于預(yù)防給藥緩解唑來膦酸引起的不良反應(yīng)。此外,我們小組前期研究發(fā)現(xiàn)青藤堿能夠抑制RANKL和LPS誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成和骨破壞,但其對腫瘤引起的破骨細(xì)胞生成和骨破壞的影響未見報導(dǎo)。因此,本課題擬研究青藤堿對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的骨破壞的影響及分子免疫機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.在體內(nèi),建立人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的骨破壞模型。將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231注射入裸鼠脛骨骨髓腔內(nèi)構(gòu)建裸鼠骨破壞模型,造模4周后,處死裸鼠并取其脛骨。通過Micro-CT分析檢測青藤堿對造模裸鼠脛骨骨小梁參數(shù)BMD、BV/TV、Tb.N以及Tb.Sp等的影響,以及HE染色評價青藤堿對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的裸鼠骨破壞中骨小梁結(jié)構(gòu)的影響。2.在體外,建立人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及培養(yǎng)上清(conditioned medium,CM)誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7分化形成破骨細(xì)胞的體系。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測青藤堿對RAW264.7細(xì)胞的增殖毒性作用;通過TRAP染色檢測青藤堿對MDA-MB-231細(xì)胞及CM誘導(dǎo)的RAW264.7向破骨細(xì)胞分化的影響;通過骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)檢測青藤堿對CM誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨吸收能力的影響;通過qRT-PCR檢測青藤堿對CM誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成相關(guān)基因表達(dá)的影響。3.收集乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的培養(yǎng)上清作為條件性培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)檢測青藤堿抑制CM誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞的作用機(jī)制。利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測青藤堿對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性的影響:利用Western blot檢測青藤堿對破骨細(xì)胞形成最重要的下游信號通路NF-κB、MAPKs(p38、JNK and ERK 1/2)、c-Fos、NFATc1 相關(guān)蛋白的影響以及qRT-PCR檢測c-fos和NFATc1的基因表達(dá)。4.探究青藤堿對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分泌的可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的相關(guān)因子的影響。利用qRT-PCR檢測青藤堿對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分泌的 TNF-α、IL-1、TGF-β、PTH-rP、M-CSF、IL-6、IL-8 等因子基因表達(dá)水平的影響。接著,利用ELISA進(jìn)一步檢測青藤堿對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分泌IL-8蛋白水平的影響。最后,為了確定IL-8在青藤堿抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成中的重要作用,我們利用qRT-PCR檢測了青藤堿對RAW264.7細(xì)胞表面的IL-8受體CXCR1表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.在體內(nèi),青藤堿能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的裸鼠溶骨性骨破壞。通過Micro-CT檢測結(jié)果以及HE染色結(jié)果顯示,與模型組相比,150 mg/kg青藤堿可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的裸鼠骨侵蝕水平。2.在體外,青藤堿可以抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及其培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞。MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,青藤堿用量小于1 mM時對RAW264.7細(xì)胞的增殖無明顯影響。TRAP染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,同誘導(dǎo)對照組相比,青藤堿可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成;骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與誘導(dǎo)對照組相比,0.5 mM青藤堿可以顯著抑制破骨細(xì)胞骨吸收陷窩的產(chǎn)生;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同誘導(dǎo)對照組比較,青藤堿可以顯著抑制TRAP、OSCAR等破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)。3.青藤堿可以通過抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、NFATc1表達(dá)來抑制破骨細(xì)胞形成,但不影響NF-κB和MAPKs信號通路的活化。NF-κB熒光素酶報告基因結(jié)果表明,0.25-1 mM青藤堿不能夠抑制CM誘導(dǎo)的NF-κB熒光素酶報告基因表達(dá)上升。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與誘導(dǎo)對照組相比,0.25-1 mM青藤堿不影響NF-κB p65和MAPKs(JNK、ERK、p38)磷酸化水平。qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同誘導(dǎo)對照組相比,青藤堿可以顯著抑制c-Fos、NFATc1破骨細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。4.青藤堿除影響破骨細(xì)胞形成的下游信號外,青藤堿還能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分泌IL-8,以及破骨前體細(xì)胞RAW264.7表面IL-8受體CXCR1的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)青藤堿可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中IL-8基因表達(dá)水平。接著,通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)青藤堿不僅可以抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分泌IL-8蛋白,而且青藤堿還可以抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和破骨前體細(xì)胞RAW264.7共培系統(tǒng)中乳腺癌細(xì)胞分泌IL-8。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,青藤堿可以明顯抑制CM誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞RAW264.7表面IL-8受體CXCR1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.在體內(nèi),青藤堿可以抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的骨破壞。2.在體外,青藤堿可以抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及其培養(yǎng)上清誘導(dǎo)的破骨前體細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞。3.青藤堿可以通過IL-8-CXCR1、c-Fos-NFATc1信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成,從而減輕乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的裸鼠溶骨性骨破壞。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

三、腫瘤誘導(dǎo)的骨破壞的形成逡逑那么，腫瘤誘導(dǎo)的骨破壞是怎樣形成的呢？目前研究較認(rèn)可的有以下２種：逡逑ＲＡＮＫＬ依賴途徑和ＲＡＮＫＬ非依賴途徑，見下圖２逡逑ＴＵｍｏｒ邋ｃｅｌｌｓ邋＠邐邐逡逑ＰＴＨ－ｆＰ邐ＩＬ－８邋ＩＬ－６邋ＩＬ－１１邋ＲＡＮＫＬ逡逑／邐ＴＮＦ－ａ邋ＩＬ－１邐＼邐、Ｓ＾逡逑／邐／邋Ｍ邋ＣＳＦ邋＼邐￣、邐＼邋ＴＧＦ－Ｐ逡逑ＪＬ邋ｕ／邐＾邐Ｐｒｅ－0Ｃ邋＼邋ｉＧＦｓ逡逑Ｐｒｅ－ＯＢ邋｛邐Ａ邋ＢＭＰ逡逑Ｂｏｎｅ＾ｔｒｔｘ逡逑Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ逡逑＃逡逑圖２腫瘤骨轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成過程（參照文獻(xiàn)［５＇１２＇１３］作圖）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ邋ｂｏｎｅ邋ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｔｕｍｏｒ邋ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．逡逑２逡逑

前言而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成與分化。ＮＦＡＴｃｌ的活化主要分兩個過程：早期和自放大階段。早期激活階段由ＮＦ－ｋＢ信號通路調(diào)控，ＡＰ－１和Ｃａ２＋參與其自放大階段［１８］。ＮＦＡＴｃｌ是調(diào)控破骨細(xì)胞分化的終末開關(guān)，直骨細(xì)胞分化和骨吸收相關(guān)的基因表達(dá)如抗酒石酸堿性磷酸酶（ＴＲＡＰ）、胞相關(guān)受體（Ｏｓｃａｒ）、金屬基質(zhì)蛋白酶９（ＭＭＰ－９）、整合素Ｐ３（ｌｎｔｅｇｒｉｎ織蛋白酶Ｋ邋（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＫ）等，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟，增加骨吸收活ＲＡＮＫＬ邐＿邐ｏｓｔｅｏｃａｓｔｐｒｏｇｅｎｍｏ．逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 魯光平;殷詠梅;周雪峰;潘驥群;陳進(jìn);;乳腺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制與靶向治療進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2017年02期

2 鐘延法;;乳腺癌患者血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平變化及其臨床意義[J];山東醫(yī)藥;2016年30期

3 劉紅;羅靈光;覃保瑜;孫雯;楊曦;黃鴻;方丹;榮曦;王洋;;塞來昔布預(yù)防唑來磷酸治療老年性骨質(zhì)疏松癥不良反應(yīng)的療效觀察[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2016年01期

本文編號：2717252