【摘要】：目的:本研究應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)人正常結(jié)腸上皮細胞構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎細胞模型,模型建立成功后使用靛玉紅干預(yù)細胞模型,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測促炎細胞因子和抑炎細胞因子表達含量的變化,明確靛玉紅的抗炎作用,并通過蛋白免疫印跡法、實時熒光定量PCR探索靛玉紅改善炎癥反應(yīng)的作用機制與靶點。材料與方法:培養(yǎng)人正常結(jié)腸上皮細胞(HCoEpiC),使用脂多糖(LPS)刺激HCoEpiC使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并根據(jù)炎癥因子IL-6釋放量確定LPS的最佳使用濃度從而明確模型建立的最優(yōu)條件,建立模型后使用不同濃度靛玉紅溶液對其進行干預(yù),分析細胞存活率以確定靛玉紅最佳用藥濃度,同時使用不同濃度靛玉紅溶液干預(yù)正常HCoEpiC,觀察靛玉紅對細胞存活率的影響,確定其安全濃度,根據(jù)上述實驗獲得條件將細胞隨機分為6組:正常組、模型組、靛玉紅組高、中、低劑量組和靛玉紅聯(lián)合組(靛玉紅+PPM-18),除正常組外均使用LPS刺激HCoEpiC細胞構(gòu)建UC模型細胞,治療組加入相應(yīng)濃度靛玉紅進行干預(yù),培養(yǎng)24小時后取材,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗測試靛玉紅對各組細胞上清液中促炎細胞因子(TNF-α、IL-12)和抑炎細胞因子(IL-4)釋放量的影響,使用實時熒光定量PCR檢測靛玉紅對NF-κB的mRNA表達的影響,使用蛋白免疫印跡法檢測靛玉紅對各組細胞PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB蛋白表達量的影響。結(jié)果:1.不同培養(yǎng)時間下HCoEpiC的生長情況將12H,24H,48H三組數(shù)據(jù)OD均值進行比較24H48H12H,與12H組進行比較,24H組OD均值顯著升高(P0.01),與12H組進行比較,48H組OD均值升高(P0.05),與24H組進行比較,48H組OD均值降低且無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.不同濃度LPS對HCoEpiC的IL-6表達影響與正常組進行對比,其余各組IL-6濃度均顯著增高(P0.01)。與5?g/ml組進行對比,10?g/ml組、15?g/ml組IL-6濃度顯著升高(P0.01)。與10?g/ml組進行對比,15?g/ml組IL-6濃度顯著升高(P0.01)。3.不同濃度靛玉紅對HCoEpiC存活率的影響與正常組進行對比,LPS組和1μmol/L組細胞存活率顯著下降(P0.01),0.5μmol/L組、0.25μmol/L組、0.125μmol/L組與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與LPS組進行對比,1μmol/L組細胞存活率上升(P0.05),0.5μmol/L組、0.25μmol/L組、0.125μmol/L組細胞存活率顯著上升(P0.01)。與1μmol/L組進行對比,0.5μmol/L組細胞存活率上升(P0.05),0.25μmol/L組和0.125μmol/L組細胞存活率顯著上升(P0.01)。0.5μmol/L組、0.25μmol/L組、0.125μmol/L組三組細胞存活率進行對比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4.不同濃度靛玉紅對LPS誘導(dǎo)HCoEpiC存活率的影響與正常組比較,其余各組細胞存活率均明顯下降(P0.01)。與LPS組比較,25μmol/L、5μmol/L組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),1μmol/L組、0.5μmol/L組、0.25μmol/L組、0.125μmol/L組細胞生存率顯著上升(P0.01)。與25μmol/L組進行比較,5μmol/L組和1μmol/L組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),0.5μmol/L組和0.25μmol/L組細胞存活率顯著上升(P0.01),0.125μmol/L組細胞存活率上升(P0.05)。與5μmol/L組進行比較,1μmol/L組和0.25μmol/L組細胞存活率上升(P0.05),0.5μmol/L組和0.25μmol/L組細胞存活率顯著上升(P0.01)。1μmol/L組、0.5μmol/L組、0.25μmol/L組和0.125μmol/L組進行組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC促炎因子TNF-α表達的影響與正常組進行對比,模型組、靛玉紅高、中、低劑量組及聯(lián)合組TNF-α表達量顯著升高(P0.01)。與模型組進行比較,靛玉紅高、中、低劑量組及聯(lián)合組TNF-α表達量顯著降低(P0.01)。靛玉紅高、中、低劑量組三組進行組間比較,TNF-α表達量差異顯著(P0.01),且靛玉紅中劑量組TNF-α表達量最低。靛玉紅中劑量組與靛玉紅聯(lián)合組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅低劑量組進行對比,靛玉紅中劑量組、靛玉紅聯(lián)合組TNF-α表達量均顯著降低(P0.01)。6.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC促炎因子IL-12表達的影響與正常組進行對比,模型組、靛玉紅高、中、低劑量組及聯(lián)合組IL-12表達量均顯著升高(P0.01)。與模型組進行對比,靛玉紅高、中、低劑量組及聯(lián)合組IL-12表達量顯著降低(P0.01)。與靛玉紅高劑量組進行對比,靛玉紅中劑量組IL-12表達量降低(P0.05),靛玉紅低劑量組和靛玉紅聯(lián)合組IL-12表達量顯著上升(P0.01)。與靛玉紅中劑量組進行對比,靛玉紅低劑量組IL-12表達量顯著上升(P0.01),靛玉紅聯(lián)合組IL-12表達量顯著降低(P0.01)。與靛玉紅低劑量組進行對比,靛玉紅聯(lián)合組IL-12表達量顯著降低(P0.01)。7.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC抗炎因子IL-4表達的影響與正常組進行對比,模型組、靛玉紅高、中、低劑量組及聯(lián)合組IL-4表達量顯著降低(P0.01)。與模型組進行對比,靛玉紅高、中、低劑量組及聯(lián)合組IL-4表達量顯著上升(P0.01)。靛玉紅高劑量組與靛玉紅中劑量組進行對比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),與靛玉紅高劑量組進行對比,靛玉紅低劑量組和靛玉紅聯(lián)合組IL-4表達量顯著降低(P0.01)。與靛玉紅中劑量組進行對比,靛玉紅低劑量組IL-4表達量顯著降低(P0.01)。與靛玉紅聯(lián)合組進行對比,靛玉紅中劑量組和靛玉紅低劑量組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。8.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC NF-κB蛋白表達量影響與正常組進行對比,模型組、靛玉紅高、中、低劑量組NF-κB蛋白表達量顯著升高(P0.01),靛玉紅聯(lián)合組NF-κB蛋白表達量升高(P0.05)。與模型組進行對比,靛玉紅高、中劑量組及聯(lián)合組NF-κB蛋白表達量顯著降低(P0.01),靛玉紅低劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅高劑量組進行對比,靛玉紅低劑量組NF-κB蛋白表達量升高(P0.05),靛玉紅聯(lián)合組NF-κB蛋白表達量顯著降低(P0.01),靛玉紅中劑量組與靛玉紅高劑量組進行對比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅高劑量組進行對比,靛玉紅聯(lián)合組NF-κB蛋白表達量降低(P0.05)。與靛玉紅低劑量組進行對比,靛玉紅高劑量組、靛玉紅聯(lián)合組NF-κB蛋白表達量顯著降低(P0.01)。9.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC NF-κB的mRNA表達影響與正常組進行對比,模型組、靛玉紅高、中、低劑量組NF-κB mRNA表達量顯著升高(P0.01),靛玉紅聯(lián)合組NF-κB mRNA表達量升高(P0.05)。與模型組進行對比,靛玉紅高、中、低劑量組及聯(lián)合組NF-κB mRNA表達量顯著降低(P0.01)。與靛玉紅高劑量組進行對比,靛玉紅低劑量組NF-κB mRNA表達量顯著升高(P0.01)。靛玉紅中劑量組、靛玉紅高劑量組、靛玉紅聯(lián)合組三組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅低劑量組進行對比,靛玉紅高劑量組、靛玉紅聯(lián)合組NF-κB mRNA表達量顯著降低(P0.01)。10.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC PI3K蛋白表達量的影響與正常組進行對比,模型組、靛玉紅高、中、低劑量組以及靛玉紅聯(lián)合組PI3K蛋白表達量顯著升高(P0.01)。與模型組進行對比,靛玉紅高、中劑量組及聯(lián)合組PI3K蛋白表達量顯著降低(P0.01),靛玉紅低劑量組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅高劑量組進行對比,靛玉紅低劑量組PI3K蛋白表達量顯著升高(P0.01),與靛玉紅高劑量組進行對,靛玉紅中劑量組和靛玉紅聯(lián)合組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅中劑量組進行對比,靛玉低劑量組PI3K蛋白表達量顯著上升(P0.01),靛玉紅中劑量組與靛玉紅聯(lián)合組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅低劑量組進行對比,靛玉紅聯(lián)合組PI3K蛋白表達量顯著降低(P0.01)。11.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC AKT蛋白表達量的影響正常組、模型組、靛玉紅高、中、低劑量組及靛玉紅聯(lián)合組組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。12.靛玉紅對LPS誘導(dǎo)的HCoEpiC p-AKT蛋白表達量的影響與正常組進行對比,模型組、靛玉紅高、中、低劑量組p-AKT蛋白表達量顯著升高(P0.01),靛玉紅聯(lián)合組與正常組進行比較p-AKT蛋白表達量升高(P0.05)。與模型組進行對比,靛玉紅高、中劑量組及聯(lián)合組p-AKT蛋白表達量顯著降低(P0.01),靛玉紅低劑量組與模型組比較p-AKT蛋白表達量降低(P0.05)。與靛玉紅高劑量組進行對比,靛玉紅低劑量組p-AKT蛋白表達量顯著升高(P0.01),靛玉紅聯(lián)合組p-AKT蛋白表達量顯著降低(P0.01),與靛玉紅高劑量組與靛玉紅中劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與靛玉紅中劑量組進行對比,靛玉低劑量組P-AKT蛋白表達量顯著上升(P0.01),靛玉紅聯(lián)合組p-AKT蛋白表達量顯著降低(P0.01)。與靛玉紅低劑量組進行對比,靛玉紅聯(lián)合組P-AKT蛋白表達量顯著降低(P0.01)。結(jié)論:1.使用LPS誘導(dǎo)HCoEpiC建立UC模型細胞通過使用LPS誘導(dǎo)HCoEpiC能夠使該細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)并釋放促炎細胞因子,從而模擬人體結(jié)腸組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。2.靛玉紅的安全性及療效適當濃度的靛玉紅對細胞活性影響極小,且該濃度靛玉紅也能降低促炎細胞因子的釋放以減輕炎癥反映,故靛玉紅對UC治療效果良好且安全可靠。3.靛玉紅能夠影響多種細胞因子的釋放靛玉紅能夠在降低促炎細胞因子TNF-α、IL-12和IL-6表達量的同時增加抑炎細胞因子IL-4的表達量,從抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多方面對UC進行治療。在本實驗中聯(lián)合組IL-12釋放量并沒有因為NF-κB信號通路活性降低而進一步減少,提示IL-12釋放量可能與其它信號通路相關(guān)性更強。4.靛玉紅能夠抑制NF-κB信號通路活性本實驗結(jié)果表明靛玉紅具有良好的抗炎作用,與模型組比較各治療組均能有效抑制NF-κB信號通路活性,而NF-κB信號通路激活其下游一系列促炎細胞因子的產(chǎn)生會導(dǎo)致UC的病情惡化,因此靛玉紅可以通過抑制其活性減少炎癥因子的分泌達到對UC的治療作用。5.靛玉紅能夠抑制PI3K/AKT信號通路活性本實驗結(jié)果表明與模型組比較各治療組均能有效抑制PI3K/AKT信號通路活性,起到抑制PI3K表達和阻斷AKT磷酸化的作用,因此靛玉紅能夠抑制PI3K/AKT信號通路活性從而控制UC的發(fā)展且降低其癌變幾率。6.靛玉紅可作用于多個治療靶點靛玉紅能夠抑制PI3K/AKT以及NF-κB信號通路活性,PI3K/AKT信號通路的激活能夠上調(diào)NF-κB信號通路的活性,NF-κB信號通路活性降低可使其下游促炎細胞因子釋放量降低,防止因PI3K/AKT信號通路活性增強從而產(chǎn)生的正反饋調(diào)節(jié),同時靛玉紅也能影響多種炎癥因子的釋放。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

均值升高（P＜0.05），與 24H 組進行比較，48H 組 OD 均值降低但兩組之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。圖1 不同培養(yǎng)時間OD值比較2. 不同濃度LPS對HCoEpiC細胞 IL-6表達水平的影響去空白，計算IL-6濃度后將不同組別結(jié)果進行對比，與正常組進行對比，5 g/ml組、10 g/ml組與15 g/ml組IL-6濃度顯著升高（P＜0.01）。與5 g/ml組進行對比，10 g/ml與15 g/ml組IL-6濃度顯著升高（P＜0.01）。與10 g/ml組進行對比，15 g/ml組IL-6濃度顯著升高（P＜0.01）。

不同濃度靛玉紅對細胞生存率的影響

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10 Q面

本文編號：2716714