【摘要】：研究背景及目的胃癌(Gastric cancer,GC)作為世界第四大最常見的癌癥,是目前全球范圍內(nèi)亟待解決的重大公共健康問題,據(jù)流行病學統(tǒng)計結(jié)果顯示,全球平均每年約有99萬人被診斷為胃癌,73.8萬人死于胃癌,因此它也是癌癥性死亡的第二大兇手。胃癌的發(fā)病率會根據(jù)年齡,性別和地域等不同而有所差異,好發(fā)年齡在50歲以上,男性胃癌的發(fā)病率是女性的2至3倍,全球范圍來看,包括中國在內(nèi)的亞洲東部、歐洲東部以及南美等地區(qū)發(fā)病率最高,而北美以及非洲大部分地區(qū)發(fā)病率最低。而隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快,飲食結(jié)構(gòu)的改變,學習及工作壓力的增加,胃癌發(fā)病人群呈現(xiàn)年輕化趨勢。具體到我國,流行病學調(diào)查分析顯示,我國胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%,在全球183個國家中位于發(fā)病率第5位、死亡率第6位。2012年中國胃癌新發(fā)病例約為42.4萬例,其中男性新發(fā)病例約為29.8萬例,女性為12.6萬例。全國總?cè)丝诩澳行晕赴┌l(fā)病率均僅次于肺癌,位居同期惡性腫瘤發(fā)病率的第2位,女性胃癌發(fā)病率低于乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌,位居第4位。2012年中國胃癌死亡病例約為29.8萬例,其中男性死亡病例約為20.6萬例,女性約為9.2萬例。全國胃癌死亡率為22.04/10萬。全國總?cè)丝诩澳行晕赴┧劳雎蕛H低于肺癌和肝癌,位居同期惡性腫瘤死亡率第3位,女性胃癌死亡率僅低于肺癌,位居第2位。我國是胃癌高發(fā)國家,胃癌仍是嚴重危害中國居民健康的主要疾病之一,降低我國胃癌的發(fā)病率和死亡率越來越成為我們必須直面的重大公共衛(wèi)生問題。目前,大多數(shù)胃癌患者被診斷為晚期胃癌,65%~75%有根治愿望的患者在接受治療后面臨的是復發(fā)及系統(tǒng)性疾病的結(jié)局。近年來,隨著科學技術(shù)的發(fā)展,胃癌診療技術(shù)不斷提高,尤其是手術(shù)、內(nèi)鏡技術(shù)、放化療、靶向治療等綜合治療方式的進步,胃癌的治療效果有所提升,但對于晚期及伴轉(zhuǎn)移病灶的胃癌患者,綜合治療的預后仍不理想。對于被診斷為不適宜手術(shù)的原位癌或轉(zhuǎn)移癌的患者,化療是重要的臨床治療手段,常用藥物有奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多西他賽、伊立替康等,但由于上述藥物在長期應用的情況下耐藥率較高且藥物細胞毒性作用很大,化療也只能為患者帶去12個月的中位生存率。因此,尋找低毒、高效的新型化學藥物用于治療胃癌具有重要意義。葫蘆素(Cucurbitacin)是一組從葫蘆科和十字花科植物中提取的天然三萜系化合物�，F(xiàn)代研究報道葫蘆素在多種腫瘤疾病中均發(fā)揮抗炎、抗腫瘤的作用,可抑制多種腫瘤細胞系的細胞生長并促進其凋亡。其中葫蘆素B、D、E、I、F、O、P和Q均可通過抑制STAT3磷酸化而抑制腫瘤細胞的增殖與分化。據(jù)報道,從瓜蔞中提取的葫蘆素D可誘導多種腫瘤細胞凋亡,可以影響Stat3及NF-κB等多種信號轉(zhuǎn)導途徑�；熣T導腫瘤細胞凋亡是臨床上腫瘤疾病治療的重要手段,葫蘆素D作為潛在的抗腫瘤藥物具有一定的研究價值。但目前關(guān)于葫蘆素D在胃癌細胞中的作用及其誘導細胞凋亡的具體分子機制尚不明確,有待進一步研究。在細胞水平,本課題研究了多濃度梯度、時間梯度下,葫蘆素D對胃癌AGS、SNU1、HS76T細胞增殖和凋亡的影響;應用SC79激活Akt的表達,左旋刀豆氨酸(L-canavanine)抑制iNOS的表達,并探討葫蘆素D發(fā)揮抗胃癌作用的潛在機制;在組織水平,本課題構(gòu)建了裸鼠移植瘤模型,在體研究葫蘆素D對胃癌增殖和凋亡的影響,旨在探討葫蘆素D對胃癌的在體作用及其分子機制。方法1.應用CCK-8法檢測不同濃度梯度及時間梯度下,Cucurbitacin D對胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞體外增殖的影響;選用DCFH-DA熒光探針檢測不同濃度Cucurbitacin D對胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞內(nèi)ROS水平的影響;應用TUNEL染色法探討Cucurbitacin D對胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞凋亡的影響;還檢測了不同濃度梯度及時間梯度下,Cucurbitacin D對胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞內(nèi)Ca~(2+)及NO含量的影響。2.通過Western blot法檢測了Cucurbitacin D對胃癌AGS細胞的iNOS、Bax等凋亡信號通路和Akt信號通路相關(guān)信號分子的蛋白表達的影響;分別選用iNOS抑制劑L-canavanine干擾胃癌AGS細胞內(nèi)iNOS的表達,選用Akt激動劑SC79干擾胃癌AGS細胞內(nèi)Akt的活化,應用CCK-8法檢測L-canavanine及SC79對Cucurbitacin D介導的抑制胃癌AGS細胞體外增殖作用的影響;應用TUNEL法檢測L-canavanine及SC79對Cucurbitacin D誘導胃癌AGS細胞體外凋亡作用的影響;給小鼠按1×10~6個細胞/只的量注射胃癌AGS細胞以構(gòu)建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,給藥途徑選用腹腔注射,觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤的生長情況,記錄瘤體長徑和短徑以計算體積,當瘤體體積達到200mm~3后,給予Cucurbitacin D及SC79腹腔注射;實驗結(jié)束后,取材,繪制裸鼠皮下移植瘤的生長曲線,檢測Cucurbitacin D及SC79對皮下移植瘤瘤體生長的影響;選用TUNEL法檢測Cucurbitacin D及SC79對皮下移植瘤瘤體組織細胞凋亡情況的影響,以分析探討Cucurbitacin D抗胃癌作用的體內(nèi)外潛在分子機制。結(jié)果1.CCK-8檢測結(jié)果顯示,Cucurbitacin D對胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞體外增殖均有抑制作用,與對照組相比,Cucurbitacin D處理組的細胞數(shù)量明顯減少,且該作用呈明顯的濃度及時間依賴性,即隨著藥物濃度的增加及藥物作用時間的延長,其抑制作用逐漸增強(P0.05);ROS檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞在經(jīng)Cucurbitacin D藥物處理后,其細胞內(nèi)ROS含量均明顯增加(P0.05),且該作用呈現(xiàn)濃度依賴性,即隨著藥物濃度的增加ROS含量逐漸增多;TUNEL染色結(jié)果顯示,與對照組相比,隨Cucurbitacin D濃度增加,胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞凋亡率均逐漸升高(P0.05);而與對照組相比,隨Cucurbitacin D濃度增加及作用時間的延長,胃癌AGS、SUN1、Hs746T細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度及NO含量均逐漸增加,且該作用呈明顯的濃度及時間依賴性(P0.05)。2.Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,隨著Cucurbitacin D濃度增加,胃癌AGS細胞中iNOS、Bax、Cleaved caspase-9及cytochrome蛋白表達量明顯增多,同時Bcl-2蛋白表達量明顯減低(P0.05);此外,Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,隨Cucurbitacin D濃度增加,胃癌AGS細胞Akt、mTOR及rs6的蛋白磷酸化水平明顯降低(P0.05)。為進一步探討Cucurbitacin D抑制胃癌細胞增殖及促凋亡作用的潛在機制,本實驗分別應用L-canavanine及SC79干預胃癌AGS細胞iNOS的表達及Akt的活化,設(shè)置對照組、Cucurbitacin D組、SC79組、Cucurbitacin D+SC79組、L-canavanine組、Cucurbitacin D+L-canavanine共六組;體外增殖與凋亡相關(guān)實驗CCK-8法、TUNEL染色結(jié)果共同表明,與正常對照組及Cucurbitacin D組相比,Akt激活劑SC79可顯著消除Cucurbitacin D對胃癌AGS細胞的體外增殖抑制和凋亡誘導作用;同樣地,與正常對照組及Cucurbitacin D組相比,iNOS抑制劑L-canavanine也可拮抗Cucurbitacin D對胃癌AGS細胞的體外增殖抑制和凋亡誘導作用;構(gòu)建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,隨機分為對照組、Cucurbitacin D組、SC79組、Cucurbitacin D+SC79四組,觀察并記錄裸鼠皮下移植瘤生長的長徑(L)及短徑(W),按公式V(mm~3)=LW~2×0.5236計算瘤體體積并繪制裸鼠皮下移植瘤生長曲線,結(jié)果顯示,與對照組相比,Cucurbitacin D可明顯抑制瘤體的生長,而SC79可拮抗該抑制作用(P0.05)。瘤體組織包埋、切片后進行TUNEL染色,實驗結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,Cucurbitacin D處理組移植瘤胃癌的棕黃色凋亡細胞更多,凋亡細胞比例更高(P0.05),而SC79處理后阻斷了Cucurbitacin D對瘤體胃癌細胞的促凋亡作用(P0.05)。結(jié)論Cucurbitacin D在體內(nèi)外均具有一定的抗胃癌作用;Cucurbitacin D可干擾iNOS表達及Akt的活化、促進細胞內(nèi)ROS、Ca~(2+)的蓄積,增加細胞內(nèi)ATP及NO的含量,通過影響iNOS/NO信號通路及Akt信號通路發(fā)揮抗胃癌作用。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

引 言amycin, mTOR）等相關(guān)信號分子的表達水平，并用抑制劑干擾 iNOS 和表達與活化后檢測它們對葫蘆素 D 抗胃癌作用的影響；在體實驗選擇裸移植瘤模型用于檢測葫蘆素 D 對胃癌體內(nèi)增殖和凋亡作用的影響。上述在明確葫蘆素 D 在體內(nèi)外具有抗胃癌作用，并探討了其可能的機制。

圖 2.1 CCK-8 法檢測 Cucurbitacin D 對胃癌 AGS、SUN1、Hs746T 細胞增殖的抑制作用選用 5 個不同濃度梯度的 Cucurbitacin D（0.25、0.5、1、1.5、2μm）及 4 個不同刺激時間梯度（12、24、48、72h）對不同胃癌細胞株 AGS 細胞株（圖 2.1A）、SUN1 細胞株（圖2.1B）和 Hs746T 細胞株（圖 2.1C）細胞增殖的影響。*表示與對照組（0μm）比較，P＜0.05。2.2 Cucurbitacin D 對胃癌細胞內(nèi) ROS 水平的影響應用 DCFH-DA 檢測細胞內(nèi) ROS 含量，其原理如下：DCFH-DA 為氧化敏感型熒光探針（無自發(fā)熒光），可穿過細胞膜而進入胞內(nèi)，在細胞內(nèi)酯酶的水解作用下生成為 DCFH，生成的 DCFH 同樣自身無熒光但無法穿過胞膜，因此DCFH 聚集在胞內(nèi)，在胞內(nèi) ROS 的作用下發(fā)生氧化作用，生成 DCF，DCF 則是有熒光的。所以，細胞內(nèi) ROS 水平的含量，可以通過檢測到的 DCF 熒光的強弱得到直觀的反應，熒光顯微鏡或熒光酶標儀均可用于檢測。有研究表明，增加細胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生是 Cucurbitacin 家族發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一。本部分研究中即通過 DCFH-DA 檢測不同濃度 Cucurbitacin D 對胃癌 AGS、SUN1、Hs746T 細胞內(nèi) ROS 水平的影響。六孔板內(nèi)放入細胞爬片培養(yǎng)

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