【摘要】：根據世界衛(wèi)生組織(WHO)的報告,抑郁癥是全人類最流行的精神疾病之一,伴隨著的癥狀包括情緒低落、動機減弱、失去興趣或快樂、自殺想法和無望等,截止2016年全世界所有年齡段的患病人數(shù)超過3.5億�？挂钟羲幬镆褟V泛用于治療抑郁癥,并在臨床指南中被推薦為中、重度抑郁癥發(fā)作的首選治療方法。但是,抗抑郁藥僅可使約50%左右的重度抑郁癥患者的癥狀得到完全緩解,且有副作用,如鎮(zhèn)靜和體重增加。雖然單胺類系統(tǒng)(包括5-羥色胺,去甲腎上腺素和多巴胺系統(tǒng))長期以來一直是抑郁癥研究和治療的焦點,但新的治療靶點和藥物的開發(fā)業(yè)已成為目前重要的探索方向之一。越來越多的證據表明,誘導抑郁癥的最重要的兩個因子慢性應激和心理創(chuàng)傷均可損傷神經元。保護神經元免受損傷可能為未來抑郁癥的防治提供新的藥物靶點。在我國,多酚類中草藥的臨床應用已有數(shù)千年歷史。多酚通常容易被胃腸道吸收并迅速穿過血腦屏障。丹皮酚(Paeonol,2'-羥基-4'-甲氧基苯乙酮,C_9H_(10)O_3)是一種典型的多酚物質,是從著名的牡丹皮中提取的酚酸化合物。已經確定的是,丹皮酚具有多種臨床治療效果。近期的研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚應用能減輕脂多糖誘導的小鼠抑郁樣行為,但其細胞分子機制仍然知之甚少。因此,在本研究中,我們運用丹皮酚治療慢性應激誘導的抑郁癥動物模型,旨在進一步理解其作用的細胞分子機制,為開發(fā)潛在的防治抑郁癥新的藥物提供實驗基礎。在本研究中,我們通過慢性不可預知溫和應激(CUMS)誘導大鼠抑郁癥模型。用曠場實驗(OFT)、高十字架迷宮實驗(EPMT)、強迫游泳實驗(FST)和糖水偏好實驗(SPT)進行行為學評價,分析丹皮酚對CUMS誘導的自主探究活動性下降、焦慮情緒、快感缺失等方面的影響。同時運用Golgi-cox染色結合Sholl分析軟件、ImageJ軟件和RECONSTRUCT三維重建軟件,分析丹皮酚對CUMS誘導的大腦神經元樹突的形態(tài)變化包括樹突長度、樹突分支數(shù)目和棘突密度變化的影響;并在此基礎上進一步通過免疫熒光雙標、western blot實驗來探究丹皮酚對CUMS誘導的腦部相關區(qū)域神經元損傷的潛在的分子機制。結果如下:1.丹皮酚可以阻止CUMS誘導的大鼠行為學損傷。慢性不可預知溫和應激導致大鼠在曠場試驗中顯示出較低的活性和較少的穿越水平格數(shù)(兩者均為P0.05),在高架十字迷宮試驗中在開放臂中花費的時間較少(P0.05),在蔗糖偏好試驗中蔗糖消耗量較少(P0.05),強迫游泳試驗中的不動時間增多(P0.01)。在曠場試驗中,對照組和氟西汀治療組(P0.05)或CUMS組和高劑量丹皮酚治療組的活性也有顯著差異(P0.05);在強迫游泳試驗中,CUMS組與氟西汀治療組(P0.01)、與低劑量丹皮酚治療組(P0.001)或與高劑量丹皮酚治療組(P0.01)差異顯著;在蔗糖偏好測試中的蔗糖消耗量,CUMS組與氟西汀治療組(P0.05)或CUMS組和高劑量丹皮酚治療組之間(P0.05)差異顯著。這些數(shù)據表明,丹皮酚治療顯著減弱CUMS誘導的行為損害。2.丹皮酚可顯著緩解CUMS誘導的大鼠相關腦區(qū)的神經元損傷。在本研究中,我們對內側額葉、杏仁核、海馬和伏隔核等相關腦區(qū)神經元樹突的長度和分支數(shù)、神經元樹突棘的密度和類型百分比進行了詳細的研究。其中,在同一神經元上,我們對神經元的頂樹突和總樹突長度分別進行了統(tǒng)計,對不同節(jié)段上樹突分支與同心圓交叉點數(shù)分別進行了統(tǒng)計,對不同區(qū)域位置即基樹突區(qū)域、頂樹突近胞體端和遠胞體區(qū)域的樹突棘密度和類型百分比分別進行了統(tǒng)計。同時根據測量的樹突棘的大小,由RECONSTRUCT三維重建軟件對激光共聚焦三維圖像進行分析,將樹突棘自動分為三種類型:絲/線型(長度1μm或長寬比1)、短棒型(ST,長寬比≤1以及長度1μm)和蘑菇/分支型(MB,寬度0.6μm或形態(tài)“分支狀”)。分析結果不難看出,慢性應激可以普遍誘導各腦區(qū)神經元樹突長度變短、樹突分支數(shù)減少,樹突棘密度降低,而氟西汀或丹皮酚的使用則可阻止或減緩這些改變。但從棘突的不同類型來分析,可以發(fā)現(xiàn),慢性應激對不同腦區(qū)影響雖有所不同,但總的來說對不同的棘突類型影響的結果是不一樣的:較為一致的現(xiàn)象是,慢性應激可降低蘑菇或分支狀型棘突的密度,但卻往往伴隨著增加絲/線型棘突的密度;同樣氟西汀或丹皮酚的使用則可阻止或減緩這些變化趨勢。因此,Paeonol緩解慢性應激誘導的相關腦區(qū)的神經元的損傷,可能主要是通過減少神經元樹突的丟失,增加功能性樹突棘——蘑菇/分支型棘突的密度,進而緩解相應的行為學表現(xiàn)。3.丹皮酚處理可有效緩解CUMS誘導的cofilin1的活性紊亂以及在神經元中的重新分布。cofilin1是組成神經元樹突棘骨架的肌動蛋白細絲重塑最重要的調節(jié)因子之一,可通過對其Ser3位點去磷酸化或從結合于膜蛋白上釋放入胞質而激活。cofilin1的過度激活或失活均可導致肌動蛋白重塑以及樹突和突觸的丟失。我們的結果顯示,慢性應激誘導了cofilin1水平在mPFC和海馬增加,而在杏仁核減少;誘導了p-cofilin1水平在杏仁核和伏隔核中增加,在mPFC中減少,而在海馬中則沒有顯著變化;同時還在一些腦區(qū)如海馬誘導cofilin1增加在胞質中的分布。這些變化,通常會在氟西汀或丹皮酚處理后得以緩解。這暗示,cofilin1的激活或失活多是通過改變其表達水平和磷酸化修飾,也有通過調節(jié)與膜蛋白的結合,另一方面cofilin1的激活或失活在不同腦區(qū)是不一樣的,具有腦區(qū)特異性;可能正是cofilin1活性的改變,影響了actin的重塑,進而改變了樹突和樹突棘的形態(tài)。4.丹皮酚處理可顯著緩解CUMS誘導的Rho GTPase(Rac1,CDC42和RhoA)水平改變。Rho GTPase作為分子開關,可以介導多種胞內外信號分子,通過多種信號通路作用下游靶蛋白,包括cofilin1。我們的數(shù)據顯示,慢性應激普遍改變了GTPase的表達水平:降低了mPFC的Rac1和RhoA水平,增加了杏仁核和海馬的Rac1和Rho A水平,降低了伏隔核的Rac1水平,卻增加了伏隔核的CDC42和RhoA水平。不同濃度的丹皮酚或氟西汀的使用多數(shù)都能緩解上述開關分子的改變。這樣的結果提示,GTPase-cofilin1信號通路可能參與了Paeonol緩解慢性應激誘導的神經元樹突棘丟失和樹突萎縮的生理過程。我們的結果還提示,在一些腦區(qū)如海馬BDNF可能通過TrKB受體介導影響GTPase-cofilin1信號通路。5.丹皮酚可顯著緩解CUMS誘導的某些腦區(qū)GSK3β和calcineurin(CaN)表達水平的變化。研究顯示,GSK3β和calcineurin可能參與慢性應激誘導的cofilin1改變和行為損傷。我們的結果揭示,在一些腦區(qū),如在杏仁核,慢性應激降低了CaN水平,丹皮酚的使用(高或低劑量)均可阻止其下降;慢性應激卻提高了GSK3β的水平,但高劑量丹皮酚或氟西汀的處理卻可以緩解GSK3β水平的提高。這說明,CaN和GSK3β在某些腦區(qū)如杏仁核也參與了Paeonol緩解慢性應激誘導的神經元樹突棘丟失和樹突萎縮的生理過程。綜上所述,丹皮酚可顯著減輕慢性應激誘發(fā)的行為損傷。這些行為的損傷可能與相關腦區(qū)的樹突棘丟失和樹突萎縮存在因果關系。與這些樹突形態(tài)改變一致的是cofilin1活性的紊亂,伴隨著不同腦區(qū)Rho GTPase表達水平的改變,以及BDNF和/或GSK3β/calcineurin的改變。上述紊亂或改變多可由丹皮酚處理得到緩解。我們的數(shù)據暗示,丹皮酚在不同腦區(qū)可以通過GTPase-cofilin1或GSK3β/calcineurin等多種信號通路減弱CUMS誘導的突觸和樹突損失,并最終改善行為缺陷。我們的實驗也提示丹皮酚可能是治療抑郁癥的潛在藥物。
【學位授予單位】：安徽師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1.上圖表示一個棘的放大。下圖為來自大鼠腦的不同多棘神經元的形態(tài)學。大腦皮質層II/III 的錐體神經元（A）；CA1（B），CA3（C）海馬區(qū);內嗅皮質層 II/III（D）; 來自紋狀體的中等棘神經元（E）以及來自這些相應區(qū)域（F-J）的樹突棘的形態(tài)。Golgi-Cox 染色所揭示的。（K）-（N）為培養(yǎng) 21 天后 DiI 染色的海馬和皮質神經元及其樹突棘圖像。（O）表示一個典型的樹突上各類型棘分支（注意：不同的參數(shù)，包括總樹突長度，樹突直徑，棘面積，棘長度和棘頭部和頸部直徑被測量）。圖截取自文獻(Maiti, Manna, Ilavazhagan,Rossignol, & Dunbar, 2015)Fig. 1 The figure above showed an enlarged spine. The figure below showed the morphologyof different spiny neurons from rat brain. Pyramidal neurons from layer-II/III of cerebralcortex (A); CA1 (B), CA3 (C) regions of hippocampus, layer-II/III of entorhinal cortex (D);medium spiny neuron from the striatum (E), and the morphology of dendritic spines fromtheses respective regions (F J) as revealed by Golgi Cox stain. (K) (N) Images ofhippocampal and cortical neurons and their dendritic spines stained by DiI after 21 days inculture. (O) schematic diagram of a typical dendritic branch with spines (Note: Differentparameters, including total dendritic length, dendritic diameter, spine area, spine length andspine head and neck diameter are measured to study spine pathology). These figures werecut from the literature:(Maiti et al., 2015) .在個體發(fā)育過程中，樹突棘的結構和功能并不固定，不斷變化表現(xiàn)出不同樹

1.1.4 分組動物適應性飼養(yǎng)一周，用 Open-field 行為學評分，選擇評分相近的動物，將大鼠隨機分為正常對照組（Co）、抑郁癥模型組(chronic unpredictable mild stress，CUMS,Cu）、氟西汀組（Fl，10mg / kg，ig）、丹皮酚低劑量組（Pl，25mg / kg，ig）和丹皮酚高劑量組（Ph，80mg / kg，ig）。正常對照組每籠飼養(yǎng) 6 只，共 36只；抑郁癥模型組、氟西汀組、丹皮酚低劑量組和丹皮酚高劑量組每籠飼養(yǎng) 1 只( 分養(yǎng)) 共 144 只。在 CUMS 誘導后一周，每日在 CUMS 前 1 小時給予氟西汀或丹皮酚 4 周。Co 的預處理是體積匹配的生理鹽水。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 許蘭芝;赫明揚;戴功;冷平;;丹皮酚對佐劑性關節(jié)炎大鼠的炎癥反應及細胞因子水平的干預作用[J];中國臨床康復;2005年39期

本文編號：2715000