【摘要】：背景肝纖維化是由長期肝損傷引起,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞在肝纖維化的進(jìn)程中扮演了重要角色,而抑制其增殖活化過程則成為肝纖維化治療的有效策略。全球范圍來看,肝纖維化和肝硬化的發(fā)病率和死亡率一直居高不下,但目前臨床卻沒有切實(shí)有效的肝纖維化治療藥物或手段,對(duì)患者及醫(yī)生造成了極大的困擾。因此我們亟需研發(fā)安全有效、具有針對(duì)性的抗纖維化制劑,解決臨床用藥難、病人病情無法得到有效控制的問題。目的本課題組前期通過鏡像mRNA展示技術(shù)獲得了具有肝星狀細(xì)胞靶向能力的功能多肽(序列:~DC~DH~DP~DR~DE~DV~DD~DV~DE~DL~DY~DS~DT~DV~DF~DG~DH,Fn14-binding peptide,簡稱D-FNB)。課題研究目的在于,開發(fā)安全有效并能靶向到達(dá)病灶部位的抗纖維化制劑,采用主動(dòng)靶向遞藥策略治療肝纖維化,其主要內(nèi)容包括多肽導(dǎo)向分子修飾靶向脂質(zhì)體的制備與表征、多肽導(dǎo)向分子修飾靶向脂質(zhì)體體外靶向性及藥效評(píng)價(jià)以及多肽導(dǎo)向分子修飾靶向脂質(zhì)體體內(nèi)靶向性及藥效評(píng)價(jià)三個(gè)方面,具體實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下:方法與結(jié)果多肽導(dǎo)向分子修飾靶向脂質(zhì)體的制備與表征。首先使用SPR和分子對(duì)接技術(shù)考察功能多肽與Fn14胞外區(qū)蛋白的結(jié)合能力和鍵合方式,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明功能多肽(序列為~DC~DH~DP~DR~DE~DV~DD~DV~DE~DL~DY~DS~DT~DV~DF~DG~DH)對(duì)Fn14胞外區(qū)蛋白有較強(qiáng)的親和力。利用MAL-PEG3400-DSPE中活化基團(tuán)馬來酰亞胺與D-FNB肽的活性巰基反應(yīng),合成得到靶向材料D-FNB-PEG3400-DSPE,采用薄層色譜法(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程,然后對(duì)水透析純化凍干。結(jié)果表明該法能夠成功合成脂質(zhì)體靶向材料D-FNB-PEG3400-DSPE。其后將傳統(tǒng)多酚類抗炎藥物姜黃素(CUR)作為藥物模型,采用薄膜水化法制備D-FNB-LIP/CUR,所得脂質(zhì)體粒徑較均一(144.21±1.14 nm),分散性良好,透射電鏡(TEM)下脂質(zhì)體形態(tài)圓整,脂質(zhì)體包封率高達(dá)94.86±2.14%,體外釋放結(jié)果表明,脂質(zhì)體上是否修飾D-FNB肽對(duì)CUR的釋放情況沒有影響。多肽導(dǎo)向分子修飾靶向脂質(zhì)體體外靶向性及藥效評(píng)價(jià)。首先使用細(xì)胞免疫熒光定性考察兩種細(xì)胞上的受體表達(dá)情況。結(jié)果表明,活化型肝星狀細(xì)胞上高表達(dá)α-SMA和Fn14受體,而正常肝細(xì)胞則低表達(dá)或不表達(dá)α-SMA和Fn14受體。說明活化型肝星狀細(xì)胞上特異性高表達(dá)Fn14受體。而后采用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀對(duì)D-FNB-LIP的體外細(xì)胞攝取進(jìn)行定性及定量評(píng)價(jià),熒光顯微鏡觀察顯示,D-FNB-LIP/Coumarin-6在肝星狀細(xì)胞上的熒光量明顯強(qiáng)于mPEG-LIP/Coumarin-6,但在正常肝細(xì)胞上的熒光攝取差別不大。同時(shí)經(jīng)流式定量攝取表明,D-FNB-LIP/Coumarin-6相較于mPEG-LIP/Coumarin-6在肝星狀細(xì)胞的熒光攝取量上提高了2.54倍,而在正常肝細(xì)胞上無明顯差異。其次,通過靶向脂質(zhì)體競爭性抑制實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)D-FNB肽能夠特異性識(shí)別Fn14過表達(dá)細(xì)胞。綜上實(shí)驗(yàn)表明,D-FNB-LIP具有良好的體外靶向性。其后通過細(xì)胞藥效MTT實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)D-FNB肽修飾脂質(zhì)體的體外細(xì)胞毒性,結(jié)果表明D-FNB-LIP/CUR(IC50=7.3μg/m L)相較于mPEG-LIP/CUR(IC50=18.6μg/m L)細(xì)胞毒性更強(qiáng),能夠有效抑制肝星狀細(xì)胞的增殖,而對(duì)正常肝細(xì)胞無明顯毒性。最后通過TUNEL細(xì)胞凋亡檢測和Western Blot探究姜黃素制劑對(duì)活化型肝星狀細(xì)胞的作用機(jī)制。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果表明,D-FNB-LIP/CUR能夠誘導(dǎo)更多活化型肝星狀細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序,進(jìn)入凋亡狀態(tài)。同時(shí)Western Blot結(jié)果顯示D-FNB-LIP/CUR可在一定程度上較多抑制活化型肝星狀細(xì)胞上α-SMA的表達(dá)。初步顯示姜黃素制劑在體外可通過導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和抑制α-SMA表達(dá)、減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成分泌的方式發(fā)揮抗纖維化藥效,以達(dá)到緩解肝纖維化的作用。多肽導(dǎo)向分子修飾靶向脂質(zhì)體體內(nèi)靶向性及藥效評(píng)價(jià)。首先使用腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠肝纖維化模型,并采用肝功生化指標(biāo)、外觀和HE、天狼猩紅染色評(píng)價(jià)不同周期造模小鼠的纖維化程度。其中血清生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示,造模八周小鼠的AST、ALT指標(biāo)遠(yuǎn)高于正常小鼠,提示肝功能異常。另外通過解剖造模小鼠肝臟發(fā)現(xiàn),正常組肝臟質(zhì)地柔軟、表面光滑、富有光澤,而模型組肝臟質(zhì)地變硬、沒有光澤、顆粒感嚴(yán)重,說明肝臟部位發(fā)生病變。而后HE染色結(jié)果顯示,造模八周小鼠的炎性細(xì)胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,中央靜脈橋接壞死并形成假小葉。天狼猩紅染色則將大量沉積于纖維隔膜和匯管區(qū)的膠原染成紅色,表現(xiàn)為紅色網(wǎng)狀纖維。綜上實(shí)驗(yàn)表明成功建立肝纖維化動(dòng)物模型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則首先使用熒光成像和體內(nèi)組織分布評(píng)價(jià)D-FNB-LIP/DiR的體內(nèi)靶向性,熒光成像實(shí)驗(yàn)證明,D-FNB-LIP/DiR相較于mPEG-LIP/DiR能顯著提高制劑在造模小鼠肝臟的分布,而在正常小鼠體內(nèi)分布區(qū)別相對(duì)較少,同時(shí)體內(nèi)組織分布結(jié)果表明,D-FNB-LIP/CUR相較于mPEG-LIP/CUR在造模小鼠肝臟分布更多,綜上提示其在造模小鼠體內(nèi)靶向性較好。其次通過組織制劑共定位實(shí)驗(yàn)考察了D-FNB肽修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)分布,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明D-FNB-LIP/Coumarin-6肝纖維化發(fā)生部位的聚集相較于mPEG-LIP/Coumarin-6更為密集,進(jìn)一步揭示了D-FNB-LIP/Coumarin-6能夠有針對(duì)性的將藥物遞送到病灶部位。此后將肝纖維化小鼠分為D-FNB-LIP/CUR組、mPEG-LIP/CUR組和生理鹽水組,利用組織免疫熒光、HE染色、天狼猩紅染色并測定肝功生化指標(biāo)、對(duì)各組藥效進(jìn)行評(píng)判。肝臟免疫熒光結(jié)果顯示,FNB-LIP/CUR治療組切片的α-SMA、Fn14表達(dá)量相較于mPEG-LIP/CUR組和生理鹽水組明顯降低。切片染色結(jié)果表明D-FNB-LIP/CUR組的肝纖維化部位相較于另外兩組恢復(fù)較好,且AST、ALT指標(biāo)有所降低,指示炎癥減輕。而mPEG-LIP/CUR組和生理鹽水組AST、ALT水平依舊很高,炎癥嚴(yán)重。以上結(jié)果表明D-FNB-LIP/CUR相較于而mPEG-LIP/CUR和生理鹽水組可明顯緩解肝臟纖維化程度,對(duì)肝纖維化具有一定的治療效果。結(jié)論綜上所述,本研究設(shè)計(jì)并制備了導(dǎo)向分子(D-FNB肽)介導(dǎo)的靶向遞藥系統(tǒng),借助主動(dòng)靶向遞藥策略,有效提高了藥物在病灶部位的蓄積,并通過體內(nèi)外藥效學(xué)研究,證實(shí)該靶向制劑所具有的治療效果。以達(dá)到抑制活化型肝星狀細(xì)胞的增殖,減輕炎癥從而減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積,改善肝纖維化的目的,本課題成功制備多肽導(dǎo)向分子修飾的包載姜黃素藥物的主動(dòng)靶向遞藥系統(tǒng),為肝纖維化的研究治療提供了有益的思路。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R283.6;R285
【圖文】：

其檢測原理為分子間相互作用力越強(qiáng)，則芯片表面折射率變化值越大。由（圖1-1A）所示，D-FNB 肽對(duì) Fn14 受體胞外區(qū)蛋白有明顯結(jié)合，且信號(hào)強(qiáng)度與多肽濃度呈正相關(guān)，而通入緩沖液時(shí)則未引起上述含肽緩沖液產(chǎn)生的信號(hào)變化，說明緩沖液對(duì)芯片信號(hào)影響不大。初步說明，D-FNB 肽能夠特異性結(jié)合 Fn14 受體胞外區(qū)蛋白，可作為潛在的 Fn14 蛋白導(dǎo)向分子用于后續(xù)研究。利用分子對(duì)接模擬 D-FNB 肽與 Fn14 受體胞外區(qū)蛋白的鍵合方式如（圖1-1B）所示為，藍(lán)色部分為 D-FNB 肽，灰色絲帶代表 Fn14 受體胞外區(qū)蛋白，黑色虛線則代表氫鍵，結(jié)果顯示，多肽上 His1 和 Arg3 的 N-末端氨基與 Fn14 胞外區(qū)蛋白（Fn14ECD）中的 Asp45 和 Asp62 產(chǎn)生靜電作用，且多肽上的 Glu4 也因靜電相互作用而與 Fn14ECD上 Arg58 相結(jié)合。多肽尾部肽的 Phe14 在與 Fn14ECD上的Arg56 形成陽離子-π 鍵相互作用。Val5

第一章 多肽導(dǎo)向分子修飾的靶向脂質(zhì)體制備及表征D-FNB 上的巰基反應(yīng)生成硫醚鍵而合成的。該反應(yīng)條件溫和，活性較高且易于鍵合。反應(yīng)所用 D-FNB 肽略過量于 MAL-PEG3400-DSPE，通過 TLC 和 MALDI-TOF監(jiān)測表明已反應(yīng)完全。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 1-2A）顯示，功能多肽 D-FNB（a），MAL-PEG3400-DSPE（b），反應(yīng)物（c）中因存在溶劑 DMF（d）而出現(xiàn)溶劑條帶，但反應(yīng)物在不同位置出現(xiàn)了褐色條帶，說明反應(yīng)混合物中已生成目標(biāo)產(chǎn)物 D-FNB-PEG3400-DSPE。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 1-2B）所示 D-FNB-PEG3400-DSPE 和 MAL-PEG3400-DSPE 的MALDI-TOF 圖譜，圖中分別為 MAL-PEG3400-DSPE 和 D-FNB-PEG3400-DSPE 的質(zhì)譜峰。圖中 MAL-PEG3400-DSPE 分子量為 4200 Da，D-FNB-PEG3400-DSPE 的分子量為 6200 Da，聚合反應(yīng)前后的分子量相差大約 2000 Da，與 D-FNB 肽分子量的理論值（1988 Da）相似，分析表明該靶向材料合成成功。

【參考文獻(xiàn)】

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1 Wen-Ce Zhou;Quan-Bao Zhang;Liang Qiao;;Pathogenesis of liver cirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

2 吳惠春;張斌;;姜黃素抗肝纖維化機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2013年01期

3 張淑娟;金麗娜;舒丹丹;王鐵闖;;脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)在肝纖維化治療的應(yīng)用[J];北方藥學(xué);2012年04期

4 鄭玉強(qiáng);鄧立普;;姜黃素藥理作用研究進(jìn)展[J];遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2011年02期

5 王振常;夏蘭;張榮臻;;活血化瘀類中藥治療肝纖維化的研究進(jìn)展[J];中國當(dāng)代醫(yī)藥;2009年24期

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1 黃睿;姜黃素抑制單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤抗小鼠肝纖維化作用[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

2 張峰;中藥活性成分姜黃素和川芎嗪作用于肝星狀細(xì)胞的抗肝纖維化機(jī)理研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2013年

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1 連娜琦;姜黃素抑制肝星狀細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路抗肝纖維化作用研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2714104