【摘要】：目的:腫瘤干細(xì)胞(CSC)是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和異質(zhì)性的主要原因。根據(jù)腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其相關(guān)信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)調(diào)控干細(xì)胞治療靶點(diǎn),靶向清除腫瘤干細(xì)胞,成為目前抗腫瘤新策略的研究熱點(diǎn)。Hippo-YAP蛋白是維持干細(xì)胞干性,溝通Hippo信號(hào)通路與其他干細(xì)胞調(diào)節(jié)通路如Wnt、hedgehod、Notch的核心分子,它的缺失或者其下游效應(yīng)蛋白YAP/TAZ的活性抑制可導(dǎo)致干細(xì)胞失去干性。祛瘀解毒湯是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心腸癌治療經(jīng)驗(yàn)用方(已申請(qǐng)專(zhuān)利),具有較好的臨床療效,對(duì)結(jié)直腸瘤細(xì)胞增殖較強(qiáng)的抑制作用。已有前期研究證實(shí)正常結(jié)直腸組織的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中YAP都呈陰性表達(dá),而癌組織中YAP可在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中都呈陽(yáng)性表達(dá),而且YAP與結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)一致。且前期臨床研究證實(shí)YAP與結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性。另外前期基礎(chǔ)研究已通過(guò)體外干細(xì)胞分離培養(yǎng),獲得并鑒定了具有干細(xì)胞特性的結(jié)腸癌干細(xì)胞。我們推測(cè)祛瘀解毒湯可以通過(guò)調(diào)控Hippo信號(hào)通路中核心蛋白YAP的表達(dá)而干預(yù)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察祛瘀解毒湯對(duì)結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響,檢測(cè)Hippo信號(hào)通路中YAP蛋白的表達(dá),以探究祛瘀解毒湯是否通過(guò)調(diào)控Hippo信號(hào)通路中YAP蛋白來(lái)干預(yù)結(jié)腸癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制,為揭示中藥復(fù)方抗癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:人結(jié)腸癌HCT116原代細(xì)胞使用無(wú)血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)12-14天后,形成肉眼可見(jiàn)HCT116干細(xì)胞克隆球。運(yùn)用CCK8法觀察單純祛瘀解毒湯、單純化療藥物以及祛瘀解毒湯聯(lián)合化療藥物對(duì)結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞細(xì)胞增殖能力的抑制作用。通過(guò)流式實(shí)驗(yàn)分析結(jié)腸癌干細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物CD44,CD133的表達(dá)率。通過(guò)體外基質(zhì)膠遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同藥物組對(duì)結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。運(yùn)用免疫熒光、western-mot方法探討祛瘀解毒湯對(duì)結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞中YAP蛋白的表達(dá)。結(jié)果:CCK-8實(shí)驗(yàn)中,同空白對(duì)照組相比,不同實(shí)驗(yàn)組(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組、2 mg/ml 5-fu組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組)干預(yù)腸癌HCT116干細(xì)胞24h、48h、72h后,發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組對(duì)腸癌干細(xì)胞HCT116細(xì)胞的增殖能力的抑制作用均具有濃度依賴(lài)性,即作用相同時(shí)間的情況下,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞存活率逐漸降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(p0.01),同時(shí)還觀察到隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),其生長(zhǎng)活力雖在也逐漸下降但是無(wú)明顯時(shí)間依賴(lài)性,也就是說(shuō),不同作用時(shí)間段相同濃度實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞活力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。(2)與陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(2mg/ml 5-fu組)相比,(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組)干預(yù)腸癌HCT116干細(xì)胞24h、48h、72h后,發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間段下單純中藥組(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組)以及中藥聯(lián)合化療藥物組(75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml5-fu組)對(duì)腸癌干細(xì)胞HCT116細(xì)胞的增殖能力的抑制作用均強(qiáng)于單純化療藥物組(2mg/ml 5-fu組),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(p0.01)。(3)單純中藥組(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組)以及中藥聯(lián)合化療藥物組(75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組)干預(yù)腸癌HCT116干細(xì)胞24h、48h、72h后,其結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)24h、48h、72h不同時(shí)間段75mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu組對(duì)細(xì)胞活力的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01,125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組對(duì)細(xì)胞活力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。流式分析儀檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞標(biāo)志物CD133+、CD44+表達(dá)的影響的實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的腸癌HCT116干細(xì)胞標(biāo)志物與空白對(duì)照組相比均明顯減少。同陽(yáng)性對(duì)照組(2 mg/ml 5-fu)相比,單純中藥組及中藥聯(lián)合化療藥物組干細(xì)胞標(biāo)志物均減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。單純中藥組與中藥聯(lián)合化療藥物組相比較,75濃度組和75+fu濃度組對(duì)干細(xì)胞標(biāo)志物的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。125濃度組和75+fu濃度組對(duì)干細(xì)胞標(biāo)志物的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。體外Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的腸癌HCT干細(xì)胞和在高倍鏡下遷移至下室的細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組相比均明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,75mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01,125mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.01,75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.01。體外Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的腸癌HCT干細(xì)胞和在高倍鏡下穿過(guò)下室的細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組相比均明顯減少。75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組(和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,75mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01,125mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.01,75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.01。流式分析儀檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2 mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物與空白對(duì)照組相比均明顯減少。同陽(yáng)性對(duì)照組(2 mg/ml 5-fu)相比,單純中藥組及中藥聯(lián)合化療藥物組EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物均減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。單純中藥組與中藥聯(lián)合化療藥物組相比較,75濃度組和75+fu濃度組對(duì)EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。125濃度組和75+fu濃度組對(duì)EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組中結(jié)腸癌干細(xì)胞HCT116中YAP蛋白在細(xì)胞漿、細(xì)胞膜和細(xì)胞核上均呈現(xiàn)明亮的綠色熒光,呈現(xiàn)強(qiáng)表達(dá),而經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2 mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu處理結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞后,同空白對(duì)照組相比較,75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組、2 mg/ml 5-fu組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組低濃度組的胞漿、胞膜和胞核均呈現(xiàn)較空白對(duì)照組弱的綠色熒光,其中125mg/ml祛瘀解毒湯組75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu組的免疫熒光較空白對(duì)照組明顯減弱。這說(shuō)明,YAP在結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞表達(dá)定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核,經(jīng)過(guò)中不同組藥物處理后無(wú)論是胞膜、胞漿還是胞核均出現(xiàn)一定程度的減弱。Western-Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu處理后的結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞,同空白對(duì)照組相比較,與HIPPO信號(hào)通路密切相關(guān)的YAP蛋白的表達(dá)水平明顯降低。同陽(yáng)性對(duì)照組2mg/ml 5-fu相比,125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu組中YAP蛋白的表達(dá)明顯較少。結(jié)論:1.在體外實(shí)驗(yàn)研究中,我們發(fā)現(xiàn)祛瘀解毒湯可顯著抑制結(jié)腸癌HCT116干細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力,具有一定的濃度依賴(lài)性,還發(fā)現(xiàn)祛瘀解毒湯可顯著抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的遷移和侵襲能力。2.祛瘀解毒湯可能通過(guò)抑制hippo信號(hào)通路中核心蛋白YAP的表達(dá)來(lái)降低結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力從而干預(yù)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。3.我們還發(fā)現(xiàn)祛瘀解毒湯聯(lián)合化療藥物可以達(dá)到更好的抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等實(shí)體瘤中鑒定分學(xué)者認(rèn)為腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的根本原因在于腫瘤干細(xì)胞樣,處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài), 多處于G0期, 而大多數(shù)細(xì)胞毒 S、M 或 G2 期的細(xì)胞,所以腫瘤干細(xì)胞可以逃避藥物的性腫瘤細(xì)胞的各種治療中得以存活[3]，成為復(fù)發(fā)的根源。P 信號(hào)通路是最新發(fā)現(xiàn)的與癌干細(xì)胞（CSC）分化密切相po 通路通過(guò)磷酸化來(lái)負(fù)調(diào)控其下游效應(yīng)分子 YAP 的轉(zhuǎn)錄,是維持細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)的重要途徑[4]。其核心調(diào)節(jié)通路而且與其他干細(xì)胞調(diào)節(jié)通路如 Wnt、hedgehod、No且 YAP 在干細(xì)胞分化和調(diào)控器官大小等方面發(fā)揮重要應(yīng)蛋白 YAP/TAZ 的活性抑制可導(dǎo)致干細(xì)胞失去干性。我腸組織的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中 YAP 都呈陰性表達(dá)，而癌組中都呈陽(yáng)性表達(dá)，而且 YAP 與結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物 CD Hippo 中 YAP 的表達(dá)與結(jié)直腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，細(xì)胞的調(diào)控有關(guān)。

P<0.01；組間兩兩比較采用 Bonferroni 法，總的結(jié)果顯示如下：表 3，圖1 結(jié)果顯示：①和空白對(duì)照組相比，不同實(shí)驗(yàn)組 (75mg/ml 祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組、2 mg/ml 5-fu 組和 75mg/ml 祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu 組)干預(yù)腸癌HCT116 干細(xì)胞 24h、48h、72h 后，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組對(duì)腸癌干細(xì)胞 HCT116 細(xì)胞的增殖能力的抑制作用均具有濃度依賴(lài)性，即作用相同時(shí)間的情況下，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（p<0.01）,同時(shí)還觀察到隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其生長(zhǎng)活力雖在也逐漸下降但是無(wú)明顯時(shí)間依賴(lài)性，也就是說(shuō)，不同作用時(shí)間段相同濃度實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞活力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。②與陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(2 mg/ml 5-fu 組)相比，(75mg/ml 祛瘀解毒湯組、125mg/ml 祛瘀解毒湯組和 75mg/ml 祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu 組)干預(yù)腸癌 HCT116 干細(xì)胞 24h、48h、72h 后，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間段下單純中藥組（75mg/ml 祛瘀解毒湯組、125mg/ml 祛瘀解毒湯組）以及中藥聯(lián)合化療藥物組（75mg/ml 祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu 組)對(duì)腸癌干細(xì)胞 HCT116細(xì)胞的增殖能力的抑制作用均強(qiáng)于單純化療藥物組（2 mg/ml 5-fu 組)，其差異具有

【參考文獻(xiàn)】

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3 張菊萍;賈勇圣;佟仲生;;microRNAs參與腫瘤干細(xì)胞的調(diào)節(jié)[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2015年01期

4 呂文姣;周京旭;;上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展[J];腫瘤學(xué)雜志;2014年06期

5 周京旭;;祛瘀解毒法聯(lián)合替吉奧治療體力評(píng)分較差或老年大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的臨床療效觀察[J];中國(guó)醫(yī)藥指南;2013年31期

6 陳曉敏;郭俊明;樂(lè)東海;夏天;李克強(qiáng);;上皮 間質(zhì)轉(zhuǎn)化:腫瘤轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控機(jī)制[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2013年09期

7 郭立達(dá);焦振霞;宋瑛;滕文華;劉釗;劉敬澤;;姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究[J];中國(guó)中藥雜志;2013年13期

8 譚光根;劉麗;李靜;胡月珍;;參芪扶正注射液對(duì)晚期結(jié)腸癌臨床療效及免疫功能影響[J];海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年05期

9 吳東輝;朱晏偉;;腸胃清介導(dǎo)CXCR4/CXCL12信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2012年23期

10 郭剛;許建華;孫玨;范忠澤;;人參皂苷Rg3對(duì)小鼠結(jié)腸癌原發(fā)瘤切除后肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)的抑制作用[J];世界華人消化雜志;2012年12期

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3 王國(guó)勝;靈芪膠囊對(duì)人源性直結(jié)腸癌lovo細(xì)胞荷瘤裸鼠HGF/SF-met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2012年

4 焦河玲;苦豆堿抗結(jié)腸癌的作用及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：2713573