【摘要】：目的:腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和異質(zhì)性的主要原因。根據(jù)腫瘤干細胞的生物學(xué)特性及其相關(guān)信號通路,發(fā)現(xiàn)調(diào)控干細胞治療靶點,靶向清除腫瘤干細胞,成為目前抗腫瘤新策略的研究熱點。Hippo-YAP蛋白是維持干細胞干性,溝通Hippo信號通路與其他干細胞調(diào)節(jié)通路如Wnt、hedgehod、Notch的核心分子,它的缺失或者其下游效應(yīng)蛋白YAP/TAZ的活性抑制可導(dǎo)致干細胞失去干性。祛瘀解毒湯是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心腸癌治療經(jīng)驗用方(已申請專利),具有較好的臨床療效,對結(jié)直腸瘤細胞增殖較強的抑制作用。已有前期研究證實正常結(jié)直腸組織的細胞核、細胞質(zhì)中YAP都呈陰性表達,而癌組織中YAP可在細胞核及細胞質(zhì)中都呈陽性表達,而且YAP與結(jié)直腸癌干細胞標(biāo)志物CD133表達一致。且前期臨床研究證實YAP與結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性。另外前期基礎(chǔ)研究已通過體外干細胞分離培養(yǎng),獲得并鑒定了具有干細胞特性的結(jié)腸癌干細胞。我們推測祛瘀解毒湯可以通過調(diào)控Hippo信號通路中核心蛋白YAP的表達而干預(yù)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的。本研究擬通過體外實驗觀察祛瘀解毒湯對結(jié)腸癌HCT116干細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響,檢測Hippo信號通路中YAP蛋白的表達,以探究祛瘀解毒湯是否通過調(diào)控Hippo信號通路中YAP蛋白來干預(yù)結(jié)腸癌干細胞轉(zhuǎn)移的機制,為揭示中藥復(fù)方抗癌轉(zhuǎn)移機制的研究提供理論支持和實驗依據(jù)。方法:人結(jié)腸癌HCT116原代細胞使用無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)12-14天后,形成肉眼可見HCT116干細胞克隆球。運用CCK8法觀察單純祛瘀解毒湯、單純化療藥物以及祛瘀解毒湯聯(lián)合化療藥物對結(jié)腸癌HCT116干細胞細胞增殖能力的抑制作用。通過流式實驗分析結(jié)腸癌干細胞干細胞標(biāo)志物CD44,CD133的表達率。通過體外基質(zhì)膠遷移和侵襲實驗檢測不同藥物組對結(jié)腸癌HCT116干細胞遷移和侵襲能力的影響。運用免疫熒光、western-mot方法探討祛瘀解毒湯對結(jié)腸癌HCT116干細胞中YAP蛋白的表達。結(jié)果:CCK-8實驗中,同空白對照組相比,不同實驗組(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組、2 mg/ml 5-fu組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組)干預(yù)腸癌HCT116干細胞24h、48h、72h后,發(fā)現(xiàn)各實驗組對腸癌干細胞HCT116細胞的增殖能力的抑制作用均具有濃度依賴性,即作用相同時間的情況下,隨著藥物濃度的增加,細胞存活率逐漸降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,(p0.01),同時還觀察到隨著藥物作用時間的延長,其生長活力雖在也逐漸下降但是無明顯時間依賴性,也就是說,不同作用時間段相同濃度實驗組對細胞活力的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。(2)與陽性實驗對照組(2mg/ml 5-fu組)相比,(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組)干預(yù)腸癌HCT116干細胞24h、48h、72h后,發(fā)現(xiàn)不同時間段下單純中藥組(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組)以及中藥聯(lián)合化療藥物組(75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml5-fu組)對腸癌干細胞HCT116細胞的增殖能力的抑制作用均強于單純化療藥物組(2mg/ml 5-fu組),其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,(p0.01)。(3)單純中藥組(75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組)以及中藥聯(lián)合化療藥物組(75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組)干預(yù)腸癌HCT116干細胞24h、48h、72h后,其結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)24h、48h、72h不同時間段75mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu組對細胞活力的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01,125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組對細胞活力的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。流式分析儀檢測不同實驗組對結(jié)腸癌HCT116干細胞標(biāo)志物CD133+、CD44+表達的影響的實驗中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的腸癌HCT116干細胞標(biāo)志物與空白對照組相比均明顯減少。同陽性對照組(2 mg/ml 5-fu)相比,單純中藥組及中藥聯(lián)合化療藥物組干細胞標(biāo)志物均減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。單純中藥組與中藥聯(lián)合化療藥物組相比較,75濃度組和75+fu濃度組對干細胞標(biāo)志物的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。125濃度組和75+fu濃度組對干細胞標(biāo)志物的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。體外Transwell遷移實驗中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的腸癌HCT干細胞和在高倍鏡下遷移至下室的細胞數(shù)與空白對照組相比均明顯減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,75mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01,125mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01,75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01。體外Transwell侵襲實驗中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的腸癌HCT干細胞和在高倍鏡下穿過下室的細胞數(shù)與空白對照組相比均明顯減少。75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組(和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,75mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01,125mg/ml祛瘀解毒湯組同2mg/ml 5-fu組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01,75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組同2mg/ml 5-fu組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01。流式分析儀檢測不同實驗組對標(biāo)志蛋白E-cadherin表達的影響實驗中,經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2 mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu處理后的EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物與空白對照組相比均明顯減少。同陽性對照組(2 mg/ml 5-fu)相比,單純中藥組及中藥聯(lián)合化療藥物組EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物均減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。單純中藥組與中藥聯(lián)合化療藥物組相比較,75濃度組和75+fu濃度組對EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。125濃度組和75+fu濃度組對EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin標(biāo)記物影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白對照組中結(jié)腸癌干細胞HCT116中YAP蛋白在細胞漿、細胞膜和細胞核上均呈現(xiàn)明亮的綠色熒光,呈現(xiàn)強表達,而經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2 mg/ml 5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu處理結(jié)腸癌HCT116干細胞后,同空白對照組相比較,75mg/ml祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組、2 mg/ml 5-fu組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu組低濃度組的胞漿、胞膜和胞核均呈現(xiàn)較空白對照組弱的綠色熒光,其中125mg/ml祛瘀解毒湯組75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu組的免疫熒光較空白對照組明顯減弱。這說明,YAP在結(jié)腸癌HCT116干細胞表達定位于細胞膜、細胞漿和細胞核,經(jīng)過中不同組藥物處理后無論是胞膜、胞漿還是胞核均出現(xiàn)一定程度的減弱。Western-Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)75mg/ml祛瘀解毒湯、125mg/ml祛瘀解毒湯、2mg/ml5-fu和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu處理后的結(jié)腸癌HCT116干細胞,同空白對照組相比較,與HIPPO信號通路密切相關(guān)的YAP蛋白的表達水平明顯降低。同陽性對照組2mg/ml 5-fu相比,125mg/ml祛瘀解毒湯組和75mg/ml祛瘀解毒湯+2mg/ml 5-fu組中YAP蛋白的表達明顯較少。結(jié)論:1.在體外實驗研究中,我們發(fā)現(xiàn)祛瘀解毒湯可顯著抑制結(jié)腸癌HCT116干細胞的生長和增殖能力,具有一定的濃度依賴性,還發(fā)現(xiàn)祛瘀解毒湯可顯著抑制結(jié)腸癌干細胞的遷移和侵襲能力。2.祛瘀解毒湯可能通過抑制hippo信號通路中核心蛋白YAP的表達來降低結(jié)腸癌干細胞的增殖、遷移和侵襲能力從而干預(yù)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。3.我們還發(fā)現(xiàn)祛瘀解毒湯聯(lián)合化療藥物可以達到更好的抑制結(jié)腸癌干細胞的增殖、遷移和侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等實體瘤中鑒定分學(xué)者認(rèn)為腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的根本原因在于腫瘤干細胞樣,處于相對靜止?fàn)顟B(tài), 多處于G0期, 而大多數(shù)細胞毒 S、M 或 G2 期的細胞,所以腫瘤干細胞可以逃避藥物的性腫瘤細胞的各種治療中得以存活[3]，成為復(fù)發(fā)的根源。P 信號通路是最新發(fā)現(xiàn)的與癌干細胞（CSC）分化密切相po 通路通過磷酸化來負調(diào)控其下游效應(yīng)分子 YAP 的轉(zhuǎn)錄,是維持細胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)的重要途徑[4]。其核心調(diào)節(jié)通路而且與其他干細胞調(diào)節(jié)通路如 Wnt、hedgehod、No且 YAP 在干細胞分化和調(diào)控器官大小等方面發(fā)揮重要應(yīng)蛋白 YAP/TAZ 的活性抑制可導(dǎo)致干細胞失去干性。我腸組織的細胞核、細胞質(zhì)中 YAP 都呈陰性表達，而癌組中都呈陽性表達，而且 YAP 與結(jié)直腸癌干細胞標(biāo)志物 CD Hippo 中 YAP 的表達與結(jié)直腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，細胞的調(diào)控有關(guān)。

P<0.01；組間兩兩比較采用 Bonferroni 法，總的結(jié)果顯示如下：表 3，圖1 結(jié)果顯示：①和空白對照組相比，不同實驗組 (75mg/ml 祛瘀解毒湯組、125mg/ml祛瘀解毒湯組、2 mg/ml 5-fu 組和 75mg/ml 祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu 組)干預(yù)腸癌HCT116 干細胞 24h、48h、72h 后，發(fā)現(xiàn)各實驗組對腸癌干細胞 HCT116 細胞的增殖能力的抑制作用均具有濃度依賴性，即作用相同時間的情況下，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，（p<0.01）,同時還觀察到隨著藥物作用時間的延長，其生長活力雖在也逐漸下降但是無明顯時間依賴性，也就是說，不同作用時間段相同濃度實驗組對細胞活力的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。②與陽性實驗對照組(2 mg/ml 5-fu 組)相比，(75mg/ml 祛瘀解毒湯組、125mg/ml 祛瘀解毒湯組和 75mg/ml 祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu 組)干預(yù)腸癌 HCT116 干細胞 24h、48h、72h 后，發(fā)現(xiàn)不同時間段下單純中藥組（75mg/ml 祛瘀解毒湯組、125mg/ml 祛瘀解毒湯組）以及中藥聯(lián)合化療藥物組（75mg/ml 祛瘀解毒湯+2 mg/ml 5-fu 組)對腸癌干細胞 HCT116細胞的增殖能力的抑制作用均強于單純化療藥物組（2 mg/ml 5-fu 組)，其差異具有

【參考文獻】

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本文編號：2713573