【摘要】：目的:探討溶酶體及NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白降解和溶酶體膜V-ATPase復(fù)合物的組裝在非酒精性脂肪肝(NAFLD)鐵代謝紊亂中作用及黃芩素拮抗效應(yīng)的潛在分子機(jī)制方法:1.動物實(shí)驗(yàn):將105只6周齡的雄性C57BL/6J小鼠(體重18-20 g)隨機(jī)分為7組:正常對照組(低脂飼料,10%脂肪供能)、高脂飼料組(高脂飼料,60%脂肪供能、黃芩素對照組(黃芩素:400 mg/kg.bw)、高鐵組對照組(羰基鐵粉w/w:0.2%)、黃芩素+高脂組(黃芩素:400 mg/kg.bw)、高脂+鐵聯(lián)合組、黃芩素+高脂+鐵組(黃芩素:400 mg/kg.bw),小鼠高脂喂養(yǎng)12周至模型成功后,處死小鼠并收集血清及組織樣本。測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及血脂水平;蘇木素-伊紅及油紅O染色觀察肝臟病理改變及脂質(zhì)沉積;測定肝組織甘油三酯、總膽固醇、氧化損傷及鐵水平相關(guān)指標(biāo);檢測溶酶體低分子質(zhì)量鐵含量、溶酶體V-ATPase復(fù)合物V1亞基表達(dá);肝臟石蠟切片孵育V-ATPase B2及溶酶體膜相關(guān)蛋白2(LAMP2)抗體觀察胞漿V-ATPase復(fù)合物V1亞基與溶酶體共定位的水平。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤氩煌母深A(yù)物及NCOA4 siRNA、Sestrin2siRNA處理經(jīng)游離脂肪酸(FFA)、黃芩素及檸檬酸鐵銨(FAC)刺激的人肝癌細(xì)胞(HepG2),BODIPY493/503染色觀察HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;檢測細(xì)胞內(nèi)NCOA4、Sestrin2、蛋白質(zhì)氧化損傷及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);銀硫染色法觀察溶酶體內(nèi)低分子質(zhì)量鐵含量;檢測細(xì)胞內(nèi)鐵水平、溶酶體V-ATPase復(fù)合物組裝及溶酶體pH值等相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果:1.黃芩素干預(yù)有效的抑制高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致的小鼠肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的釋放、脂肪變性與氧化損傷;與高脂喂養(yǎng)小鼠組相比,黃芩素干預(yù)升高了1.56倍肝臟總鐵(p0.05),和1.27倍游離鐵(LIP)的水平(p0.05)。同時,高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠溶酶體氧化還原活性鐵含量升高了5.23倍(p0.05)、溶酶體胞漿組織蛋白酶B的活性增加了20.8%(p0.05)、成熟形式組織蛋白酶D表達(dá)降低、溶酶體膜V-ATPase復(fù)合物V1亞基表達(dá)降低,胞質(zhì)蛋白V-ATPase B2與LAMP2共定位減少,而黃芩素干預(yù)部分逆轉(zhuǎn)了上述變化。2.黃芩素干預(yù)能改善FFA刺激導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,LIP下降、溶酶體活性鐵沉積及溶酶體功能。Bafilomycin A1處理導(dǎo)致FFA孵育的HepG2細(xì)胞鐵蛋白蓄積,胞漿LIP降低及溶酶體氧化還原活性鐵含量進(jìn)一步升高,部分抵消了黃芩素的保護(hù)效應(yīng),Rapamycin刺激能恢復(fù)FFA處理的細(xì)胞溶酶體pH值,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白重鏈(FTH)及胞漿LIP升高(p0.05),溶酶體低分子質(zhì)量鐵含量降低。3.黃芩素干預(yù)能進(jìn)一步增加高脂喂養(yǎng)小鼠Sestrin2蛋白水平、降低mTOR表達(dá)、溶酶體內(nèi)ROS及增高線粒體膜電位(MMP)(p0.05)。抑制Sestrin2表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞鐵蛋白蓄積,胞漿LIP降低、溶酶體內(nèi)氧化還原活性鐵含量增加、pH升高及胞質(zhì)蛋白V-ATPase B2與溶酶體膜LAMP2共定位減少(p0.05),部分抑制了黃芩素的保護(hù)效應(yīng)。敲低細(xì)胞內(nèi)Sestrin2的表達(dá),導(dǎo)致mTOR磷酸化表達(dá)增高,抑制黃芩素對mTOR調(diào)控作用;加入Rapamycin處理降低mTOR表達(dá),且能降低黃芩素干預(yù)細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白水平,升高細(xì)胞內(nèi)LIP含量(p0.05),降低溶酶體內(nèi)pH值。同時,敲低細(xì)胞內(nèi)Sestrin2的表達(dá),導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基化水平增加,黃芩素抗氧化能力減弱;加入N-acetylcysteine處理降低蛋白質(zhì)氧化損傷程度,且能降低黃芩素干預(yù)細(xì)胞內(nèi)FTH表達(dá)及溶酶體內(nèi)pH值,但鐵蛋白輕鏈(FTL)表達(dá)增加(p0.05)。4.抑制蛋白酶體活性不能抑制黃芩素對鐵蛋白降解的作用及溶酶體功能的保護(hù)效應(yīng);自噬抑制劑能部分阻滯黃芩素介導(dǎo)的鐵蛋白降解,降低胞漿內(nèi)LIP水平,但對溶酶體內(nèi)氧化還原活性鐵含量無影響。黃芩素干預(yù)拮抗FFA引起的NCOA4與p62蓄積、Beclin1降低(p0.05);NCOA4敲低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)FTH蓄積,抑制黃芩素對鐵蛋白的降解作用,降低胞漿內(nèi)LIP水平(p0.05);在FAC與FFA聯(lián)合處理組,抑制NCOA4表達(dá),能降低溶酶體內(nèi)氧化還原活性鐵及胞漿內(nèi)LIP水平(p0.05),部分恢復(fù)溶酶體膜穩(wěn)定性及增高溶酶膜V-ATPase復(fù)合物V1亞基表達(dá)。結(jié)論:溶酶體V-ATPase復(fù)合物組裝和溶酶體及NCOA4介導(dǎo)鐵蛋白降解在非酒精性脂肪肝肝鐵紊亂中發(fā)揮重要的作用,黃芩素能促進(jìn)溶酶體V-ATPase復(fù)合物組裝,降低溶酶體pH值,增強(qiáng)溶酶體及NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白降解可能是改善非酒精脂肪肝鐵減少的重要機(jī)制之一;并且黃芩素可以上調(diào)Sestrin2抑制mTOR表達(dá),減輕氧化應(yīng)激而增強(qiáng)溶酶體V-ATPase復(fù)合物組裝,恢復(fù)溶酶體酸性環(huán)境;調(diào)節(jié)Sestrin2/mTOR/ROS可能是黃芩素改善非酒精脂肪肝致溶酶體V-ATPase復(fù)合物組裝異常的主要分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2713117