【摘要】：環(huán)境中常見的致病菌可分為:革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌,這些致病菌嚴(yán)重危害人類健康。隨著抗生素的不合理使用,病原菌對藥物的耐受性在不斷增加。天然抗菌化合物結(jié)構(gòu)和類別復(fù)雜多樣,一個(gè)化合物即可作用多個(gè)靶點(diǎn),菌株對其不易產(chǎn)生耐藥性,因此許多研究者把目標(biāo)轉(zhuǎn)向從植物中尋找高效、天然、具有抗菌活性的化合物。桑枝作為傳統(tǒng)中藥材,具有較高的藥用價(jià)值和保健作用,歷代很多醫(yī)藥書籍中都有關(guān)于其治療腳氣的記載,如著于公元960-1279年宋代的《本草圖經(jīng)》中就有這樣的記載:“療遍體風(fēng)癢干燥,腳氣風(fēng)氣,四肢拘攣”,但其是否具有治療腳氣的效果,效果如何,這值得我們用現(xiàn)代的研究手段來進(jìn)行研究驗(yàn)證。紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum,T.rubrum)是腳氣的主要致病菌,關(guān)于桑枝提取物對紅色毛癬菌的抑制活性尚未報(bào)道。同時(shí),研究顯示,植物在處于逆境(過酸過堿、干旱脅迫、物理刺激、化學(xué)刺激、微生物侵害等)時(shí),其自身會(huì)合成一些新的化合物或顯著提高一些已有化合物的含量,來抵御逆境。故本論文以T.rubrum為初試菌株,對微生物誘導(dǎo)處理后的桑枝提取物進(jìn)行抑制T.rubrum的活性研究,利用活性貢獻(xiàn)度研究方法,在抗菌活性跟蹤下,分離、純化、鑒定出其主要抗菌活性成分—氧化白藜蘆醇(oxyresveratrol,OXY),同時(shí)研究了OXY對其它3種條件致病菌的抗菌活性,并對其抑菌活性機(jī)制進(jìn)行了探索性研究,同時(shí)檢測OXY與抗生素聯(lián)合使用的抑菌效果,為利用桑枝開發(fā)抗菌生物制劑提供了理論參考依據(jù)。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1桑枝提取物抑制T.rubrum的主要活性成分研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,桑枝提取物及其各萃取物對T.rubrum具有一定的抑制作用。其中,乙酸乙酯萃取物(TEE,約占總提物的50%),對紅色毛癬菌的抑制活性最強(qiáng),最小抑菌濃度(MIC)為1.00 mg/mL;其次是石油醚萃取部分(TPE,約占總提取物的2%)和桑枝總提取物(TAE),當(dāng)其濃度為1.00 mg/mL時(shí),其抑制率分別為84.31%和83.01%;最后是正丁醇萃取部分(TNE,約占總提取物的20%)和剩余水部分(TWE,約占總提取物的30%),當(dāng)其濃度為1.00 mg/mL時(shí),其抑制率分別為50.98%和44.44%。在抑制T.rubrum活性跟蹤下,通過活性貢獻(xiàn)度研究方法,利用各種分離純化及鑒定手段,從TEE中純化出一個(gè)主要活性單體化合物—OXY。經(jīng)研究,OXY對T.rubrum的抑制活性較好,其MIC值為0.50 mg/mL,IC_(50)為0.065 mg/mL,其在TEE抑制T.rubrum活性中的貢獻(xiàn)度約為80.52%,在TEE抑制T.rubrum活性中起到了主要作用,是桑枝中主要的抗菌活性物質(zhì)之一。協(xié)同抑菌試驗(yàn)表明OXY與硝酸益康唑(MN)聯(lián)合使用對T.rubrum的MIC值均降低為原來的1/2 MIC。通過兩種藥物組合的FICI指數(shù),得出OXY與MN聯(lián)合使用對T.rubrum的抑制作用具有疊加效應(yīng)。2 OXY對大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)的抗菌活性微量肉湯稀釋法研究顯示OXY能改變菌株的生長速度,延長了菌株的對數(shù)期與穩(wěn)定期,且對3種菌株具有殺傷作用,其對E.coli、S.aureus、C.albicans的MIC值分別為1.00 mg/mL、0.50 mg/mL、1.00 mg/mL;最小殺菌濃度(MBC)分別為4.00 mg/mL、0.50 mg/mL、4.00 mg/mL。同時(shí),OXY與抗生素的協(xié)同效應(yīng)研究中,其與慶大霉素(GS)聯(lián)合使用對E.coli的MIC_(聯(lián)合)值為各自的1/2 MIC值,MBC_(聯(lián)合)1/2 MIC_(各自),對S.aureus的MIC_(聯(lián)合)值為各自的1/4 MIC,MBC_(聯(lián)合)=1/2 MIC;OXY與MN聯(lián)合使用對C.albicans的MIC_(聯(lián)合)值為各自的1/4 MIC,MBC_(聯(lián)合)1/2 MIC_(聯(lián)合)。通過兩種藥物組合的FICI指數(shù),得出OXY與GS聯(lián)合使用對E.coli的抑制作用具有疊加效應(yīng),對S.aureus的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng);OXY與MN聯(lián)合使用對C.albicans的抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。3 OXY抗菌機(jī)制研究透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),OXY能夠改變菌株的細(xì)胞形態(tài),導(dǎo)致胞質(zhì)著色變淺,出現(xiàn)空洞,同時(shí)還導(dǎo)致E.coli和C.albicans的質(zhì)壁分離,并破壞了S.aureus和C.albicans的細(xì)胞壁;細(xì)胞膜完整性檢測發(fā)現(xiàn),OXY雖然未對3種菌株的細(xì)胞膜產(chǎn)生明顯的破壞作用,但改變了其構(gòu)象;同時(shí)OXY抑制了3種菌株生物膜的形成,從而影響了菌株的生長與繁殖。該研究為利用桑枝開發(fā)天然抗菌生物制劑提供了理論參考依據(jù),具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。OXY作為一種安全的天然產(chǎn)物,可作為一種抗菌添加劑,廣泛應(yīng)用于護(hù)膚品或保健品中;同時(shí)OXY也可以和抗生素聯(lián)合使用來輔助治療一些由細(xì)菌或真菌感染所引起的疾病,從而降低抗生素的使用量。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 3-3 化合物 TLC 圖-3 The TLC picture of液溶解，進(jìn)行質(zhì)譜(M + 1］+，同時(shí)，F(xiàn)AB-的分子質(zhì)量為 244.03 3-4 化合物 MS 檢測

圖 3-3 化合物 TLC 圖Fig. 3-3 The TLC picture of compound將重結(jié)晶單體化合物用DMSO溶液溶解，進(jìn)行質(zhì)譜(MS)鑒定，結(jié)果如圖3-4所示，F(xiàn)AB+-MSm/z 給出了準(zhǔn)分子離子峰 245.05［M + 1］+，同時(shí)，F(xiàn)AB--MS m/z 給出了準(zhǔn)分子離子峰 243.05［M + 1］-；因此，可確定此化合物的分子質(zhì)量為 244.03，這與 OXY 的相同。圖 3-4 化合物 MS 檢測圖Fig. 3-4 The MS picture of compound其磁共振數(shù)據(jù):1H-NMR ( 400 MHz，DMSO) δ: 7. 35 ( 1H，d，J = 8.5Hz

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2712948