【摘要】：目的:內皮細胞功能障礙是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的基礎,本研究通過對動物腹腔注射LPS誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷模型的研究以及給藥Aspirin后的病理改變的探討,從中西醫(yī)兩方面評價Aspirin對“熱毒血瘀”型內皮損傷模型的治療作用。用中醫(yī)基礎理論解釋LPS誘導“熱毒血瘀”的病因以及Aspirin的治療機制,并為以后以中醫(yī)基礎理論研究西醫(yī)西藥或指導西醫(yī)西藥治病提供實驗依據(jù)。方法:(1)臨床問卷調查尋找血瘀癥生物指標,并通過誘導“熱毒血瘀”證動物模型驗證相關生物指標:根據(jù)早期文獻查閱,制作“關于對心血管疾病相關中醫(yī)證型的臨床指標差異性調查問卷”。邀請該領域內的醫(yī)生和學者進行問卷回答,根據(jù)醫(yī)生及學者的回答,分析統(tǒng)計出符合血瘀型心血管疾病的生物指標。確定好血瘀癥的生物指標后,通過“熱毒血瘀”型動物模型驗證相應指標。腹腔注射LPS誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷。采用隨機分組原則將24只大鼠隨機分為3組,即正常組、低劑量模型組以及高劑量模型組,每組8只大鼠。動物實驗的1-7天采用腹腔注射方式,分別給予生理鹽水、100μg/kg LPS和30μg/kg LPS溶液。觀察動物狀態(tài)、飲食及體重變化。實驗進行第8天開始取材。腹腔主動脈取血,血液一部分用來檢測血液流變學指標,如全血還原粘度、紅細胞積壓、紅細胞聚集指數(shù)、血沉以及纖維蛋白原;另一部分取血清用來檢測各種試劑盒,如TG、TC、Apo-A、Apo-B、SOD、LPO、TXB2和6-keto-PGF1α等;取胸主動脈做免疫熒光,檢測血管內皮層中VE-Cadherin、ZO1等連接蛋白構成的血管內皮細胞層的完整性。(2)Aspirin治療LPS誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷的藥效學研究:利用LPS(2μg/mL)刺激小鼠血管內皮細胞造成炎癥模型,采用不同濃度的Aspirin干預細胞。將細胞分為正常對照組、LPS 造模組、0.1 mmol/L、0.5mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L和3mmol/LAspirin組以及地塞米松陽性藥對照組。刺激劑與藥物孵育內皮細胞24小時后開始試驗。MTT、LDH及細胞增殖實驗檢測細胞活性,篩選出藥物的濃度;免疫熒光檢測內皮細胞連接蛋白201/Z02的表達,內皮細胞膜滲透性檢測和跨內皮細胞電阻檢測一起判斷內皮細胞膜的破損情況,檢測一氧化氮的釋放量以此判斷內皮細胞功能的變化。將48只C57BL/6小鼠采用隨機分組原則分為正常對照組(Control),模型組(LPS組),陽性藥組(Dexamethasone,0.0182mg/kg),低劑量 Aspirin 組(12.5mg/kg),中劑量 Aspirin 組(62.5mg/kg)以及高劑量阿 Aspirin 組(125mg/kg)。LPS 采用 100μg/kg的濃度造模。連續(xù)干預7天,第8天處死小鼠并取材。將小鼠的心臟冰凍切片為8μm厚的薄片,冷凍保存。采用免疫熒光共定位的方法檢測小鼠心臟微循環(huán)血管內皮細胞緊密連接蛋白的完整性:VWF/ZO1,VWF/ZO2。(3)Aspirin治療LPS誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷的機制研究:利用LPS(2μg/mL)刺激小鼠血管內皮細胞造成炎癥模型,采用不同濃度的Aspirin干預細胞。將細胞分為正常對照組、LPS 造模組、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L Aspirin組。刺激劑與藥物孵育內皮細胞24小時后開始試驗。細胞內ROS被DCFH-DA探針染上熒光后由細胞實時檢測顯微鏡檢測;ROS的釋放量,Western Blot檢測的TXNIP蛋白的表達量以及免疫熒光共定位TXNIP/NLRP3的結果共同確定NLRP3炎癥小體的形成與活化和ROS/TXNIP信號通路有關。Westem Blot檢測NLRP3、ASC、Caspase-1、HMGB1和RAGE蛋白的表達以及免疫熒光共定位NLRP3/ASC,NLRP3/Caspase-1,以此判定炎癥小體的形成和活化情況。shRNA沉默RAGE以及gRNA沉默NLRP3表達后檢測內皮細胞連接蛋白的表達,確定Aspirin改善內皮細胞功能障礙與NLRP3炎癥小體活化后所激活的HMGB1-RAGE軸密切相關。運用前期冰凍保存的小鼠心臟冰凍切片,采用免疫熒光共定位的方法檢測小鼠切片中心臟微循環(huán)血管內皮細胞中NLRP3炎癥小體的形成與活化:NLRP3/Caspase-1、VWF/HMGB1。酶聯(lián)免疫吸附法進一步測定小鼠血清中HMGB1的含量。結果:(1)臨床問卷調查尋找生物指標,并通過動物模型驗證相關生物指標與動物模型的對應性:對調查問卷進行統(tǒng)計分析,“熱毒血瘀”型心血管疾病的生物指標的選擇有:血液流變學指標,血脂代謝指標TG、TC,載脂蛋白代謝指標Apo-A、Apo-B,TXA2-PGI2相對平衡指標TBX2和6-keto-PGF1α,氧自由基體系指標SOD和LPO等。實驗結果發(fā)現(xiàn),全血還原粘度、紅細胞聚集指數(shù)和血沉在LPS刺激下明顯升高,且呈濃度依賴性增加;紅細胞積壓變化不明顯。檢測到的纖維蛋白原的變化也在LPS刺激下呈劑量依賴性的增加。LPS刺激下血清中TG、TC的含量升高,但高劑量LPS的刺激沒有低劑量LPS刺激下增長的多;Apo-B/Apo-A的比值隨著LPS劑量的增加比值逐步升高。SOD酶的活性在低劑量LPS的刺激下被激活,高劑量的LPS刺激下SOD酶的活性也有所增加,但無統(tǒng)計學意義;LPO在LPS的刺激下含量升高,但無統(tǒng)計學意義。6-keto-PGF1α和TXB2的表達量在LPS刺激下含量增加,6-keto-PGF1α的含量時隨LPS劑量的增加而增多,TXB2的表達量在低劑量LPS刺激時最高,高劑量LPS刺激時的含量會比低劑量的含量少;但是TXB2/6-keto-PGF1α的比值卻隨著LPS劑量的增加而減小。隨著給藥LPS劑量的增加,內皮層連接蛋白VE-Cadherin、ZO1的完整性遭到破壞,且破壞程度越來越嚴重,破壞區(qū)域越來越多。(2)Aspirin治療LPS誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷的藥效學研究:對小鼠內皮細胞進行MTT和LDH實驗,檢測所選LPS濃度、Aspirin濃度以及地塞米松對細胞的低毒性,其中認為3 mmol/L Aspirin對細胞具有毒性。運用細胞實時監(jiān)測顯微鏡檢測細胞增殖情況,LPS、2mmol/L和3mmol/LAspirin會抑制細胞增殖,3mmol/LAspirin是明顯抑制,而其他濃度Aspirin能恢復細胞的增殖,所以認為高濃度Aspirin,即3mmol/L對細胞有毒性,因此將該濃度舍棄。接下來檢測內皮功能變化,發(fā)現(xiàn)LPS刺激后連接蛋白破損,細胞膜通透性增大,細胞電阻變小,一氧化氮釋放量減少,這些說明了內皮細胞功能紊亂;給藥Aspirin后情況得到好轉,連接蛋白的表達得到修復,細胞膜通透性得到改善,細胞電阻得到回升,一氧化氮釋放量明顯增多,說明了 Aspirin的有效性,且效果隨濃度的增加而越來越明顯;但給藥地塞米松后,內皮細胞功能紊亂沒有得到改善。對小鼠心臟切片進行免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)LPS的刺激會導致內皮緊密連接蛋白Z01/Z02的表達量明顯降低;地塞米松干預能使緊密連接蛋白得到恢復;低濃度和高濃度Aspirin干預后的Z01/Z02的表達也得到了修復,但中濃度Aspirin對恢復內皮細胞的緊密連接蛋白沒有起到恢復作用。(3)Aspirin治療LPS誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷的機制研究:細胞實時檢測顯微鏡檢測細胞內ROS,LPS刺激會增加細胞內ROS的釋放,Aspirin干預可以抑制ROS的釋放 Western Blot檢測內皮細胞的TXNIP、NLRP3、Caspase-1、HMGB1等蛋白的表達量變化,發(fā)現(xiàn)LPS刺激會增加這些蛋白的表達量,而Aspirin干預可以抑制蛋白的表達。但ASC表達量在LPS刺激和Aspirin干預情況下均不變,但用免疫熒光共定位的方法檢測TXNIP/NLRP、NLRP3/ASC和NLRP3/Caspase-1的募集情況就會發(fā)現(xiàn),LPS 刺激會增加 TXNIP/NLRP3,NLRP3/ASC,NLRP3/Caspase-1 的共定位區(qū)域,而給藥Aspirin后共定位區(qū)域會減少。運用shRNA技術轉染RAGE以及運用gRNA技術轉染NLRP3后的內皮細胞用來檢測檢測內皮連接蛋白,發(fā)現(xiàn)無論是LPS刺激還是Aspirin干預,其連接性無明顯變化。共染小鼠心臟冰凍切片NLRP3/Caspase-1,發(fā)現(xiàn)LPS刺激增加了共定位區(qū)域,并且地塞米松、中濃度Aspirin的干預不能減少兩種熒光之間的共染,低濃度和高濃度Aspirin均能減少兩種熒光間的共定位;共染VWE/HMGB1也得到同樣的結果。Elisa試劑盒檢測小鼠血清中HMGB1含量,低濃度Aspirin能減少HMGB1在血清中含量,但其余兩種濃度的Aspirin無抑制作用,地塞米松卻能有效的降低血清中HMGB1的含量。結論:1.LPS成功誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷模型2.Aspirin可通過恢復內皮細胞連接蛋白功能而起到治療“熱毒血瘀”型內皮損傷的治療作用3.Aspirin修復內皮細胞連接蛋白的藥理作用與NLRP3炎癥小體信號通路密切相關
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

．圖１．邋Ａｓｐｉｒｉｎ治療內皮損傷假設通路圖逡逑義逡逑ＬＰＳ誘導“熱毒血瘀”型內皮損傷模型逡逑化應激誘導ＮＬＲＰ３炎癥小體活化的信號通路機制出發(fā)，檢測ＡｓｐｉｒｉｎＮＬＲＰ３，Ａｉｒ

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本文編號：2712859