【摘要】：研究背景:肺癌是全球范圍內(nèi),最為常見的惡性腫瘤,導致大量的癌癥患者死亡(每年全球總數(shù)約為700萬),肺癌發(fā)病率高且生存期短,最為多見的肺癌類型就是非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。在中醫(yī)傳統(tǒng)古籍中就有相關“肺癌”病癥的描述,如“肺積”“肺癰”等,圍繞“整體辯證”的論治思想,眾醫(yī)家結合肺癌患者的證型靈活選用中藥復方發(fā)揮其優(yōu)勢:抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡、增強肺癌患者機體免疫力等。本研究中的白露湯是在臨床中自擬中藥復方,適用于氣陰兩虛、痰瘀蘊肺型的肺癌患者。研究目的:研究白露湯對人肺腺癌A549的抑制作用以及與順鉑的協(xié)同增效作用,探討其對人肺腺癌A549的Warburg效應的作用及調控機制,為白露湯臨床應用提供實驗依據(jù)。研究方法:第一部分:白露湯對人肺腺癌A549細胞抑制作用采用三維(3D)培養(yǎng)法培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞系,應用血清藥理學方法,制備SD大鼠白露湯含藥血清。隨機分為8組:對照組(A組)、白露湯含藥血清低劑量組(B組)、白露湯含藥血清中劑量組(C組)、白露湯含藥血清高劑量組(D組)、順鉑組(E組)、順鉑加白露湯含藥血清低劑量組(F組)、順鉑加白露湯含藥血清中劑量組(G組)和順鉑加白露湯含藥血清高劑量組(H組)。A549細胞常氧條件下3D培養(yǎng)72h后,按照分組分別加入相應的含藥血清或藥物繼續(xù)培養(yǎng)48h。檢測各組細胞培養(yǎng)上清液的pH值;CCK8法檢測各組細胞活力;酶標儀檢測各組細胞乳酸(LD)和三磷酸腺苷(ATP)水平的變化;流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況;Western-Blot法和RT-PCR法檢測各組細胞葡萄糖轉運體-1(GLUT1)、己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶-2(PKM2)、乳酸脫氫酶-A(LDH-A)和低氧誘導因子-1α(HIF-1α)的基因及蛋白的表達。第二部分:白露湯對人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制作用清潔級雄性BALB/c-nu裸鼠,右側背下皮膚接種人肺腺癌A549細胞,制備A549裸鼠移植瘤模型。經(jīng)篩選后隨機分為8組:對照組(A組)、白露湯低劑量組(B組)、白露湯中劑量組(C組)、白露湯高劑量組(D組)、順鉑組(E組)、順鉑加白露湯低劑量組(F組)、順鉑加白露湯中劑量組(G組)和順鉑加白露湯高劑量組(H組)。除對照組和順鉑組外,其余各組分別灌胃給予相應的濃度的白露湯劑,每日1次,連續(xù)給藥3周。順鉑組和順鉑加白露湯低、中、高劑量組腹腔注射順鉑(2 mg/kg),每3 d注射1次。對照組灌胃給予等體積的生理鹽水。觀測腫瘤的生長曲線和抑瘤率;HE染色檢測腫瘤病理變化;比色法檢測腫瘤組織中乳酸、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平;TUNEL法檢測細胞凋亡;免疫組化法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達;Western-Blot法和RT-PCR法檢測各組細胞葡萄糖轉運體-1(GLUT1)、己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶-2(PKM2)、乳酸脫氫酶A(LDH-A)和低氧誘導因子1α(HIF-1α)基因及蛋白的表達。研究結果:第一部分白露湯對人肺腺癌A549細胞的抑制作用結果1.CCK8檢測細胞活力結果:各給藥組與對照組相比,均有不同程度降低,有明顯差異(P0.05);與順鉑組相比,順鉑加白露湯含藥血清低劑量組、順鉑加白露湯含藥血清中劑量組和順鉑加白露湯含藥血清高劑量組細胞活力均有不同程度降低,且隨著白露湯含藥血清劑量的增加細胞活力下降。2.A549細胞內(nèi)乳酸、ATP結果:與對照組相比,各給藥組乳酸、ATP水平均有不同程度降低,(P0.01)有顯著差異;與順鉑組相比,順鉑加白露湯含藥血清低劑量組、順鉑加白露湯含藥血清中劑量組和順鉑加白露湯含藥血清高劑量組細胞LD、ATP水平均有不同程度降低,且隨著白露湯含藥血清劑量的增加,其LD、ATP水平隨之下降。3.流式細胞儀結果:各給藥組細胞與對照組細胞相比后,細胞凋亡率均有不同程度升高(P0.05);與順鉑組相比,順鉑加白露湯含藥血清低劑量組、順鉑加白露湯含藥血清中劑量組和順鉑加白露湯含藥血清高劑量組細胞凋亡率均有不同程度升高,隨著白露湯含藥血清劑量的增加,其細胞凋亡率升高。4.RT-PCR與Western blot結果:各組細胞GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α的基因及蛋白表達與對照組相比,均有不同程度的降低,有明顯差異(P0.01);與順鉑組相比,順鉑加白露湯含藥血清低劑量組、順鉑加白露湯含藥血清中劑量組和順鉑加白露湯含藥血清高劑量組細胞GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α的基因及蛋白的表達均有不同程度降低,隨著白露湯含藥血清劑量的增加,A549的GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表達隨之降低。第二部分白露湯對人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制作用結果1.腫瘤體積和瘤重結果:各給藥組與對照組相比,腫瘤體積和瘤重均有不同程度減小,P0.01;與順鉑組相比,順鉑加白露湯低劑量組、順鉑加白露湯中劑量組和順鉑加白露湯高劑量組腫瘤體積和瘤重均有不同程度減小,且隨著白露湯劑量的增加,其腫瘤體和瘤重隨之降低。2.HE染色結果:與對照組相比,各給藥組腫瘤組織腫瘤細胞數(shù)目明顯減少,細胞核固縮,胞質腫脹或融合,結締組織增多并繞分隔腫瘤細胞,毛細血管明顯減少。隨著白露湯劑量的增加,上述病理表現(xiàn)加重。3.乳酸、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP結果:與對照組比較,各給藥組腫瘤組織中LD、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平均有不同程度降低,P0.01;順鉑加白露湯低劑量組、順鉑加白露湯中劑量組和順鉑加白露湯高劑量組與陽性組相比,腫瘤組織中LD、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平均有不同程度降低,隨著白露湯劑量的增加,其LD、Na~+-K~+-ATP和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP水平隨之下降。4.免疫組化結果:與對照組相比,其它組腫瘤組織中細胞凋亡數(shù)目、Bax和Caspase-3蛋白表達均有不同程度增多,Bcl-2蛋白表達明顯減少,有明顯差異P0.01;與陽性組相比,順鉑加白露湯低劑量組、順鉑加白露湯中劑量組和順鉑加白露湯高劑量組腫瘤組織中細胞凋亡數(shù)目、Bax和Caspase-3蛋白表達均有不同程度增多,Bcl-2蛋白表達明顯減少,且隨著白露湯劑量的增加,變化越明顯。5.RT-PCR與Western blot結果:與對照組比較后,其它組的腫瘤組織中GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表達均有不同程度的降低,(P0.01、P0.05);與陽性藥物組相比,順鉑加白露湯低劑量組、順鉑加白露湯中劑量組和順鉑加白露湯高劑量組腫瘤組織中GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表達均有不同程度的降低,隨著白露湯劑量的增加,組織中GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A和HIF-1α基因及蛋白的表達隨之降低。研究結論:通過體外和體內(nèi)實驗研究表明1.白露湯對人肺腺癌A549有明顯的抑制作用,與順鉑聯(lián)合能增強其抑制效果。2.白露湯能通過降低人肺腺癌A549 LDH和ATP水平,從而抑制腫瘤細胞的能量代謝。3.白露湯能通過調控人肺腺癌A549凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表達,從而促進腫瘤細胞的凋亡的發(fā)生和發(fā)展。4.白露湯能通過抑制GLUT1、HK2、PKM2、LDH-A、HIF-1α的基因與蛋白表達,從而調控人肺腺癌A549糖酵解過程。 【學位授予單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285

【圖文】：

圖 4.2 腫瘤細胞能量反應詳解圖糖酵解與抗癌治療細胞生物學、細胞病理學的研究深入，，肺癌的治療鎖定于腫瘤細目標治療。以往的治療主要是采用細胞毒作用的藥物，會對正常生損傷。近十年來，代謝組學與蛋白質組學為開發(fā)潛在的抗癌藥一個令人興奮的治療方法，拓展了對腫瘤的治療視野，發(fā)現(xiàn)改變的能量代謝是治療的關鍵，通過對細胞內(nèi)微環(huán)境（主要是能量代

分組 OD 值A 1.443±0.026B 1.301±0.122*C 1.263±0.111*D 1.173±0.081*E 1.215±0.096*#F 1.213±0.032*G 1.197±0.042*H 1.132±0.080* 與 對 照 組 比 較 ，*P＜ 0.01； 與 E 組 比 較 ，#P＜ 0.01。

【參考文獻】

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本文編號：2712240