【摘要】：目的:胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)又名山核桃、核桃楸,為胡桃科胡桃屬植物。在《遼寧省中藥標準》中,記載了胡桃楸的根皮、樹皮和果皮具有抗腫瘤作用,同時民間也記載口服胡桃楸水煎液治療惡性腫瘤。已有文獻研究報道了胡桃楸不同部位有機溶劑提取物在體內外的抗腫瘤作用,但對胡桃楸水提物的研究較少。本課題組已經從胡桃楸莖枝、果、葉和根中分析鑒定了100余種化合物。為了進一步明確胡桃楸水煎液口服后能夠吸收入體內的成分,本論文在課題組前期研究結果的基礎上,對胡桃楸莖枝水提物的體外抗腫瘤作用,及其體外吸收、代謝的成分進行了研究。為胡桃楸的藥效物質基礎研究奠定了基礎。材料與方法:1.材料1.1本論文所研究的藥材樣品胡桃楸莖枝,采摘于遼寧省大連市普蘭店蓮山鎮(zhèn),趁鮮切片、冷凍干燥。1.2實驗動物SD大鼠,雄性,購于遼寧長生生物技術有限公司。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心空氣層流架SPF級環(huán)境中。1.3 Caco-2細胞購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司,來自于人源結腸癌組織。人胃癌細胞(HGC-27)購自上海博古生物科技有限公司,來自于人源未分化胃癌;高分化人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)購自上海細胞庫。2.方法2.1胡桃楸莖枝水提物的制備及化學成分研究:采用熱回流和真空冷凍干燥的方法制備胡桃楸莖枝水提物凍干粉。以UHPLC-MS/MS分析和鑒定胡桃楸莖枝水提物中的化學成分。2.2體外抗腫瘤作用和毒性研究:分別以胡桃楸莖枝水提物對人胃癌細胞(HGC-27)和高分化的人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)的增殖抑制作用作為評價指標,采用MTT比色法評價胡桃楸水提物對HGC-27和SH-SY5Y細胞形態(tài)和相對增殖率(RGR)的影響,進而評價胡桃楸莖枝水提物對腫瘤細胞的選擇性抑制作用。2.3 Caco-2細胞模型中吸收和代謝研究:采用MTT比色法評價胡桃楸莖枝水提物對Caco-2細胞的相對增殖抑制率,判斷細胞毒性,確定給藥濃度;采用胡桃楸莖枝水提物與Caco-2細胞共培養(yǎng),將一定濃度的胡桃楸莖枝水提物作用于Caco-2單層細胞,收集細胞破碎液,通過UHPLC-MS/MS聯(lián)用技術分析和鑒定Caco-2細胞中吸收和代謝的成分。2.4大鼠離體外翻腸囊模型中吸收和代謝研究:以乳酸脫氫酶(LDH)評價大鼠離體外翻腸段的活性,以確定大鼠離體外翻腸囊模型的取樣時間和給藥濃度;應用UHPLC-MS/MS分析和鑒定胡桃楸莖枝水提物在十二指腸、空腸和回腸中吸收和代謝的成分。2.5沒食子酸和逆沒食子酸的體外人肝微粒體代謝研究:選用人源肝微粒體,模擬人體內環(huán)境,以對照藥物非那西丁的代謝確定肝微粒體活性、優(yōu)化孵育條件;通過UHPLC-MS/MS分析鑒定胡桃楸水提物中主要成分沒食子酸和逆沒食子酸在人肝微粒體孵育體系中的代謝產物。結果:1.胡桃楸莖枝水提物的制備及化學成分研究:胡桃楸莖枝水提物凍干粉的得率為12.5%,計算生藥量為8 g·g~(-1)。共鑒定了胡桃楸莖枝水提物中99個成分,包括53個鞣質、33個有機酸、10個萘烷衍生物、2個氨基酸和1個黃酮。2.體外抗腫瘤作用和毒性研究:在體外抗腫瘤作用與毒性研究中,加入不同濃度胡桃楸莖枝水提物后,當濃度≤0.1 mg·mL~(-1)時,對HGC-27和SH-SY5Y細胞未顯示細胞毒性;當濃度達0.5 mg·mL~(-1)時,胡桃楸莖枝水提物對HGC-27細胞的RGR為51.48%,有明顯的細胞毒性;此時對SH-SY5Y細胞無細胞毒性。當濃度達1.0mg·mL~(-1)時,胡桃楸莖枝水提物對HGC-27細胞的RGR為45.45%,有明顯的細胞毒性;SH-SY5Y細胞的RGR為88.16%,仍無細胞毒性。3.Caco-2細胞模型中吸收和代謝研究:在胡桃楸莖枝水提物對Caco-2細胞毒性研究中,濃度在0.2~2.0 mg·mL~(-1)范圍內,Caco-2細胞的相對增殖抑制率均75%,細胞毒性均≤1,說明在該濃度范圍內,胡桃楸莖枝水提物對Caco-2細胞無毒性作用,故選定在Caco-2細胞吸收模型中胡桃楸莖枝水提物濃度為0.8 mg·mL~(-1)。最終分析鑒定了胡桃楸莖枝水提物在Caco-2細胞模型中吸收的成分2個,分別為檸檬酸和沒食子酸,代謝的成分1個,推測為二甲氧基苯甲酸,代謝途徑為去羥基及甲基化。4.大鼠離體外翻腸囊模型中吸收和代謝研究:以LDH釋放量為指標,確定大鼠離體外翻腸囊模型的取樣時間為150 min,胡桃楸莖枝水提物的給藥濃度為0.005 g·mL~(-1)(以生藥計)。分析鑒定了胡桃楸莖枝水提物在十二指腸、空腸和回腸中吸收成分共41個,包括鞣質(13個)、有機酸(16個)、萘烷(9個)、二芳基庚烷(2個)和木脂素(1個)五類化合物。鑒定了十二指腸、空腸和回腸中代謝的成分共11個,其中10個為與葡萄糖醛酸結合的產物、1個為硫酸酯化產物。其原形成分包含了胡桃楸莖枝水提物中的鞣質類成分3個,有機酸類成分2個,萘烷類成分6個。5.沒食子酸和逆沒食子酸的體外人肝微粒體代謝研究:建立的肝微粒體孵育體系能夠將非那西丁代謝為對乙酰氨基酚,代謝率約為74.89%,說明在試驗條件下,人源肝微粒體有生物活性。繼而研究了沒食子酸和逆沒食子酸在該孵育體系中的代謝,結果未發(fā)現(xiàn)兩者的代謝產物,但發(fā)現(xiàn)加入沒食子酸和逆沒食子酸后能夠使孵育體系中的成分發(fā)生變化。結論:1.胡桃楸莖枝水提物中成分主要為鞣質、有機酸、萘烷衍生物等。2.胡桃楸莖枝水提物在體外對腫瘤細胞的增殖具有選擇性抑制作用。3.胡桃楸莖枝水提物中主要成分:鞣質、有機酸和萘烷衍生物能夠通過小腸壁或Caco-2細胞壁而被吸收。小腸壁代謝酶主要使吸收成分發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝反應。4.初步推測沒食子酸和逆沒食子酸在體外代謝模型中不發(fā)生代謝反應。
【圖文】：

胡桃楸水提物的體外吸收與代謝研究上述實驗方法加熱回流 1 h，收集水煎煮液，過濾殘渣，共重復兩次，最后一次用 500 mL純凈水潤洗飲片，合并 3 次水煎煮液和潤洗液后，經布氏漏斗真空抽濾得到的濾液，再用減壓旋轉蒸發(fā)儀（60 ℃）減壓濃縮至 60 mL，將濃縮液于-80 ℃冷凍 12 h，用真空冷凍干燥機（-50 ℃，10 pa）干燥 48 h，，即得胡桃楸莖枝水提物凍干粉，稱量重量為 25 g，簡稱凍干粉。其制備流程如下圖 1-1 所示。

遼寧中醫(yī)藥大學 2019 屆碩士學位論文出來，每次稱取 200 g 凍干飲片，共提取 3 次，得到紅棕色水提物凍干粉共 75 g，計算凍干粉的得率為 12.5%，即胡桃楸莖枝水提物凍干粉生藥量為 8 g/g。再分別通過UHPLC-DAD 檢測技術，在 270 nm 處測定隨機兩個批次的胡桃楸莖枝水提物凍干粉的成分，色譜圖結果如圖 1-2 所示，表明隨機兩批次的水提物凍干粉在相同條件下測定的成分相同且穩(wěn)定、重復性較好，實驗室提取胡桃楸莖枝水提物的制備流程方法可行。胡桃楸莖枝水提物中化學成分鑒定詳見論文二第二節(jié)的內容。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2710589