【摘要】：乙型病毒性肝炎(Hepatitis B Virus,HBV)感染帶來嚴(yán)重的社會問題。乙肝感染進(jìn)一步發(fā)展易進(jìn)展為肝纖維化或者肝癌導(dǎo)致極高的死亡率,給社會發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。乙肝的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,現(xiàn)有的研究已經(jīng)證明乙肝病毒并不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷,機(jī)體對抗原不斷的免疫應(yīng)答是造成肝損傷的主要原因。在機(jī)體抗病毒免疫中,T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞。有很多學(xué)者指出,宿主對HBV抗原耐受主要是由于CD4 T淋巴細(xì)胞功能不足或缺陷引起的。因此,研究機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用,尤其是對CD4 T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用給乙肝的治療提供了新的方向和策略。在我國,多年來傳統(tǒng)中藥在治療肝炎時已得到廣泛應(yīng)用。中藥山豆根始載于唐代《開寶本草》,主要功效是清熱解毒,利咽消腫。近代臨床常用于治療咽炎黃疸,心律失常等病癥。山豆根主要成分包括生物堿、黃酮、三萜、多糖等。其中生物堿是山豆根主要活性成分,也是其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。山豆根生物堿包括以下四種類型:苦參堿型、金雀花堿型、奧豆堿型(鷹爪豆堿型)和羽扇豆堿型。大量文獻(xiàn)報道氧化苦參堿具有抗病毒,調(diào)節(jié)免疫,改善炎癥狀態(tài)等藥理作用。最近有研究表明,氧化苦參堿可以抑制Hep G2.2.15細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠HBV的復(fù)制,抑制HBs Ag和乙型病毒性肝炎e抗原(Hepatitis B e Antigen,HBe Ag)的表達(dá)。氧化苦參堿被證實在清除血清HBe Ag和HBV DNA方面有類似干擾素-α的作用。而槐果堿被證實具有抗柯薩奇B病毒作用及免疫調(diào)節(jié)功能。本研究以免疫健全的HBV水動力小鼠模型為實驗?zāi)Ｐ?以氧化苦參堿為研究對象對其抗病毒作用及免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究;以刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷模型為實驗?zāi)Ｐ?以槐果堿為研究對象對其保肝抗炎作用及機(jī)制進(jìn)行研究,以擴(kuò)大山豆根活性成分的現(xiàn)代臨床應(yīng)用。第一部分基于HBV水動力模型的氧化苦參堿抗病毒作用及免疫學(xué)機(jī)制研究目的:研究氧化苦參堿對HBV水動力小鼠的抗病毒作用及免疫學(xué)機(jī)制。方法:1.通過尾靜脈快速注射約小鼠體積10%質(zhì)粒的含質(zhì)粒生理鹽水溶液建立慢性HBV感染小鼠模型。2.通過檢測HBV DNA復(fù)制水平,HBs Ag、HBe Ag、乙型病毒性肝炎核心抗原(Hepatitis B core Antigen,HBc Ag)的表達(dá),評價氧化苦參堿對HBV的清除作用。3.根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法檢測血清干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎癥因子的表達(dá)。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞及其細(xì)胞因子比例的變化,以探討氧化苦參堿抗病毒的免疫學(xué)機(jī)制。結(jié)果:1.與模型組相比,恩替卡韋可以顯著促進(jìn)HBV DNA轉(zhuǎn)陰,恩替卡韋給藥1,3,6周顯著抑制HBV DNA復(fù)制。氧化苦參堿20 mg·kg~(-1)給藥第3,6周可有效抑制HBV DNA復(fù)制。而氧化苦參堿2.2 mg·kg~(-1)和6.7mg·kg~(-1)在抑制HBV DNA復(fù)制方面效果不明顯。2.與模型組氧化苦參堿20 mg·kg~(-1)可以顯著促進(jìn)HBs Ag,HBe Ag和肝內(nèi)HBc Ag的清除,而恩替卡韋對HBs Ag清除效果不顯著。氧化苦參堿20 mg·kg~(-1)在清除HBe Ag和肝內(nèi)HBc Ag的表達(dá)方面效果優(yōu)于恩替卡韋。3.ELISA結(jié)果顯示,氧化苦參堿6.7 mg·kg~(-1)和20 mg·kg~(-1)可明顯促進(jìn)小鼠血清IFN-γ表達(dá),而對TNF-α表達(dá)無影響。4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,氧化苦參堿劑量依賴性地促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ而不影響白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)比例。結(jié)論:1.氧化苦參堿可促進(jìn)模型小鼠HBV DNA的清除,但藥理作用相對較弱。2.氧化苦參堿可顯著抑制HBs Ag、HBe Ag和肝內(nèi)HBc Ag表達(dá),其效果優(yōu)于恩替卡韋。3.氧化苦參堿對HBV的清除作用與其促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ相關(guān)。第二部分槐果堿對Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用及免疫學(xué)機(jī)制研究目的:基于Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷模型探討槐果堿對其保護(hù)作用及機(jī)制。方法:1.BALB/c小鼠預(yù)先以槐果堿和雙環(huán)醇連續(xù)灌胃給藥5天,空白組以生理鹽水灌胃。末次給藥30分鐘后,除空白組外,其余小鼠尾靜脈注射15 mg·kg~(-1)Con A,構(gòu)建小鼠免疫性肝損傷模型。2.通過小鼠血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)肝臟病理切片及TUNEL染色評價槐果堿對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用。3.根據(jù)ELISA、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR),流式細(xì)胞術(shù)及蛋白免疫印跡法探討槐果堿的保肝抗炎作用及免疫學(xué)機(jī)制。結(jié)果:1.與空白組相比,模型組ALT、AST、TBIL表達(dá)顯著升高。與模型組相比,槐果堿給藥組可以顯著抑制血清ALT、AST和TBIL的異常升高。肝臟病理切片和TUNEL染色顯示,槐果堿給藥組可有效抑制肝臟炎癥細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞凋亡壞死。2.RT-PCR數(shù)據(jù)顯示,槐果堿可以抑制肝臟趨化因子和黏附因子巨噬細(xì)胞炎性蛋白~(-1)α(Macrophage inflammatory protein~(-1)α,MIP~(-1)α)、CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和細(xì)胞間黏附分子~(-1)(Intercellular adhesion molecule~(-1),ICAM~(-1))m RNA的表達(dá)。3.ELISA結(jié)果顯示,槐果堿可以顯著抑制IFN-γ和TNF-α的表達(dá),且對IFN-γ的抑制呈劑量依賴性。4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,槐果堿可以降低脾淋巴細(xì)胞IFN-γ的比例。5.進(jìn)一步機(jī)制研究表明,槐果堿通過上調(diào)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子1(Suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)表達(dá)抑制信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子1(Signal transducers and activators of transcription1,STAT1)的激活抑制Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷。結(jié)論:1.槐果堿對Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。2.槐果堿可以抑制肝臟趨化因子和黏附因子MIP~(-1)α、CXCL10和ICAM~(-1) m RNA的表達(dá)。3.槐果堿可以抑制血清和脾淋巴細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)。4.槐果堿通過上調(diào)SOCS1表達(dá)抑制STAT1的激活,抑制Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷。5.槐果堿對Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用與其抑制IFN-γ/STAT1信號通路相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2710379