發(fā)布時(shí)間：2020-06-12 00:57

【摘要】：目的:研究壯藥玉郎傘(YLS)石油醚部分中17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(MHBFC)的分離,及其對eNOS基因敲除小鼠壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)的作用,以期為該藥在臨床應(yīng)用方面提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)玉郎傘MHBFC的分離取YLS干燥根的飲片,用70%乙醇進(jìn)行提取,再用石油醚、乙酸乙酯萃取,待萃取完畢后分別將萃取液合并減壓濃縮,得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。采用硅膠柱層析色譜法(200-300目),將石油醚萃取物進(jìn)行梯度洗脫,收集流分,TLC檢識后將相同流分合并,減壓濃縮后將粗產(chǎn)品再次進(jìn)行硅膠柱層析和重結(jié)晶,并通過IR、1H NMR、13C NMR及X-射線單晶衍射檢測,最后鑒定得到3個(gè)單體化合物(其中化合物1為MHBFC)。(2)心室重構(gòu)模型的建立將野生型C57BL/6j小鼠和eNOS基因敲除小鼠按體重(BW)隨機(jī)分為手術(shù)組和假手術(shù)組,用4%的水合氯醛(0.1ml/10g)腹腔注射進(jìn)行麻醉,小鼠右側(cè)臥位,于左肋骨下方,大腿上方縱行切開約1cm,找到腹主動(dòng)脈,手術(shù)組小鼠用24號針頭平行放于腹主動(dòng)脈上方,6-0號線將針頭和腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎,當(dāng)看到腎臟由鮮紅色變?yōu)榛野咨珪r(shí),迅速拔出結(jié)扎針頭,此時(shí),腹主動(dòng)脈被縮窄成與24號針頭一樣粗細(xì)的大小;假手術(shù)組小鼠只游離腹主動(dòng)脈,不進(jìn)行結(jié)扎。最后用4-0號線將小鼠的傷口縫合,再次消毒后,將小鼠放回籠中靜待蘇醒。(3)術(shù)后分組、給藥及指標(biāo)檢測術(shù)后第4天,將手術(shù)組存活的野生型小鼠按體重隨機(jī)分為3組,每組10只,加上假手術(shù)組小鼠,一共4組,分別為:假手術(shù)組;模型組;MHBFC 24mg/kg組;MHBFC 12mg/kg組。同理,將eNOS基因敲除小鼠根據(jù)相同的方法進(jìn)行分組。動(dòng)物分組后灌胃給藥,假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積的0.5%CMC-Na溶液,每天1次,連續(xù)6周。于給藥后1,3,5周采用多通道生物信號分析系統(tǒng)觀測小鼠的血壓(SBP)和心率(HR)。實(shí)驗(yàn)完成后,采集相關(guān)標(biāo)本,用ELISA法測定小鼠血漿中白介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,HE染色觀察心臟和血管的病理學(xué)改變,Masson’s染色觀察心臟膠原沉積的情況,透射電鏡觀察心臟超細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化,免疫組化法檢測心臟組織中內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)的表達(dá),RT-PCR法檢測心臟組織中心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、β-肌球蛋白重鏈基因(β-myosin heavy chains,β-MHC)心房腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、及血清淀粉樣蛋白A(Serum amyloid A,SAA)的m RNA的表達(dá)。結(jié)果:(1)從YLS石油醚萃取部分中分離得到3個(gè)化合物:化合物1為MHBFC,桔色方晶,分子式為C18H14O4,相對分子質(zhì)量為294.30;化合物2為水黃皮素,白色針晶,分子式為C18H12O4,相對分子質(zhì)量為292.30;化合物3為2″,2″-二甲基-吡喃-[5″,6″:8,7]黃酮,白色針晶,分子式C20H16O3,相對分子質(zhì)量為304.34。這3個(gè)化合物均為首次從YLS石油醚萃取部分中分離得到。(2)MHBFC對SBP、HR的影響:經(jīng)MHBFC治療后,與模型組相比,野生型小鼠的SBP和HR均顯著降低(P0.05),eNOS基因敲除小鼠的SBP及HR沒有顯著性差異。(3)MHBFC對臟器指數(shù)的影響:經(jīng)藥物治療后,與模型組相比,野生型小鼠MHBFC 24 mg/kg組的心臟、左心室、右心室、肺臟、腎臟重量指數(shù)均顯著下降,但是eNOS基因敲除小鼠的心臟、左心室、右心室、肺臟、腎臟重量指數(shù)沒有顯著性差異。(4)MHBFC對炎癥因子IL-6的影響:與模型組相比,野生型小鼠MHBFC 24 mg/kg組血漿中IL-6的水平顯著降低(P0.01),eNOS基因敲除小鼠的IL-6水平?jīng)]有顯著性差異。(5)MHBFC對心肌細(xì)胞及心肌膠原沉積的影響:與模型組相比,野生型小鼠MHBFC治療組的心肌細(xì)胞面積、心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)及心肌血管周圍膠原面積(PVCA)均顯著降低(P0.01,P0.01,P0.01),eNOS基因敲除小鼠的心肌細(xì)胞面積、CVF及PVCA無顯著性變化。(6)MHBFC對血管重構(gòu)的影響:經(jīng)MHBFC治療后,野生型小鼠MHBFC 12 mg/kg和MHBFC 24 mg/kg組的血管肥厚程度均顯著降低(P0.05及P0.05),血管橫截面積顯著下降(P0.05及P0.01),血管厚度顯著降低(P0.01及P0.01),血管半徑、內(nèi)半徑、外半徑均顯著下降(P0.05);eNOS基因敲除小鼠各血管重構(gòu)指標(biāo)均有所下降,但是與模型組相比沒有顯著性差異。(7)MHBFC對BNP、β-MHC、ANP、SAA m RNA以及ET-1蛋白的影響:與模型組相比,野生型小鼠MHBFC治療組的4個(gè)基因以及ET-1蛋白的表達(dá)量均顯著下降,eNOS基因敲除小鼠4個(gè)基因的表達(dá)量以及ET-1蛋白的表達(dá)量均無顯著性變化。(8)MHBFC對心肌超微結(jié)構(gòu)的影響:野生型小鼠模型組的線粒體體積明顯變大、不與心肌纖維平行、排列紊亂、偶見壞死線粒體,Z線模糊,心肌纖維溶解斷裂,甚至變成點(diǎn)狀。經(jīng)過MHBFC治療后,癥狀明顯改善,線粒體平行于心肌纖維排列,Z線清晰。eNOS基因敲除小鼠各組的線粒體體積均明顯增大、數(shù)量增多、且出現(xiàn)大面積壞死,偶見線粒體空泡,Z線模糊,心肌纖維斷裂溶解,形狀各異。經(jīng)MHBFC治療后,給藥組小鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)沒有得到明顯的改善。結(jié)論:(1)MHBFC存在于YLS石油醚萃取部分中,分離方法簡單且產(chǎn)率高。(2)MHBFC 12,24 mg/kg具有明顯逆轉(zhuǎn)野生型小鼠心室重構(gòu)的作用,但是對逆轉(zhuǎn)eNOS基因敲除小鼠心室重構(gòu)的效果不明顯。(3)MHBFC逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用機(jī)制與eNOS基因有關(guān),其對小鼠心室重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)作用依賴于eNOS基因。
【圖文】：

該種屬植物主要生長在熱帶及亞熱帶在我國，則主要分布在西南部及臺(tái)灣，傘藥理作用較多，且成分復(fù)雜，其中，M 年首次從其根部的乙酸乙酯萃取物中分且產(chǎn)率低，為提高產(chǎn)率，本研究采用與留石油醚萃取液，，通過對石油醚萃取部發(fā)現(xiàn)其它的化合物。本課題組前期研究12]、抑制心肌細(xì)胞凋亡[13]和改善心肌缺血心室重構(gòu)的進(jìn)程中，可以改善 eNOS-NO從而提高 eNOS 的表達(dá)，但是其逆轉(zhuǎn)心因還尚未清楚。

玉郎傘 MHBFC 的分離及其對 eNOS 基因敲除小據(jù)2 有兩個(gè)最大吸收波長，分別為 UV-vis(DMSO)λm物 3 只有一個(gè)最大吸收波長，為 UV-vis(DMSO)λm圖 2 所示：
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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