【摘要】：糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)最為常見和嚴重的微血管并發(fā)癥之一,早期預(yù)防可降低糖尿病致死、致殘率,減輕國家巨大的醫(yī)療負擔(dān)。目前DR的發(fā)病機制尚不明確,表觀遺傳調(diào)控成為近年來的研究熱點。持續(xù)高糖狀態(tài)下引起的表觀遺傳修飾的變化,在DR的發(fā)病中起重要作用,早期對其修飾的相關(guān)靶點進行藥物干預(yù)對于逆轉(zhuǎn)DR的發(fā)病進程十分關(guān)鍵�！霸缙谥谓j(luò)、全程通絡(luò)”是課題組預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的原創(chuàng)性理論,基于此,在DR的預(yù)防中主要使用益氣溫陽通絡(luò)法,臨床己有多年臨床積累,益氣溫陽通絡(luò)方根據(jù)益氣溫陽、活血化瘀通絡(luò)的原則組方而成。前期研究表明,本方可調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài),改善視網(wǎng)膜血管微循環(huán),但具體作用機制尚不十分明確,值得進一步研究。研究目的:(1)探討在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變發(fā)生前預(yù)防性給予益氣溫陽通絡(luò)方,是否可以延緩糖尿病大鼠DR的發(fā)生,改善血管內(nèi)皮功能。(2)探討益氣溫陽通絡(luò)方是否可以通過降低伊文思藍滲漏量,上調(diào)緊密連接蛋白的表達,從而降低視網(wǎng)膜血管通透性,保護血——視網(wǎng)膜屏障。(3)探討益氣溫陽通絡(luò)方是否可以通過上調(diào)microRNA-200b,下調(diào)VEGF與PEDF比值,以及上調(diào)Ang-1、Tie-2等關(guān)鍵靶基因的表達,從而改善視網(wǎng)膜內(nèi)皮功能障礙,預(yù)防DR發(fā)生。(4)探討益氣溫陽通絡(luò)方是否可以通過上調(diào)microRNA-146a,調(diào)控NF-κB和P38-MAPK通路,下調(diào)ICAM-1、TNF-α的表達,抑制炎癥狀態(tài),預(yù)防DR發(fā)生。(5)探討益氣溫陽通絡(luò)方是否可以改善胰腺病理損害、增加胰島素表達、減少胰高血糖素表達,改善IRS-1的表達,從而延緩DR發(fā)生和發(fā)展。研究方法:(1)雄性SD大鼠160只,隨機分為正常對照組(n=40)、糖尿病模型組(n=40)、中藥組(n=40)、西藥組(n=40)。各組DM模型大鼠通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(2%的STZ,60mg/kg)建立DM模型。中藥組、西藥組于造模成功次日分別以等效劑量的益氣溫陽通絡(luò)方(42ml/kg·d)、羥苯磺酸鈣(104mg/kg·d)灌胃治療,正常組、模型組大鼠灌胃正常蒸餾水,于0、4、8、12、16、20、24周分別檢測各組大鼠體重及隨機血糖,于病程12或24周處死大鼠,并取材用于相關(guān)實驗。采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變;采用視網(wǎng)膜血管消化鋪片和過碘酸希夫染色(PAS)染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管的病理學(xué)改變。另外,采用雄性SD大鼠和BN大鼠各6只,隨機分為正常對照組(n=6)、DM模型組(n=6),使用Micron-III視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)進行眼底觀察和熒光造影檢查,觀察各組大鼠DR的病理表現(xiàn)。(2)采用伊文思藍(EB)灌注觀察DR大鼠視網(wǎng)膜血管滲漏情況;采用免疫組化染色法、Western blot、RT-PCR 法分別檢測各組大鼠 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5的表達。(3)采用TUNEL法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞凋亡情況;免疫組化染色法檢測VEGF、PEDF、Tie-2、ICAM-1在視網(wǎng)膜的表達;Western blot檢測VEGF、VEGFR、PEDF、Ang-1、Tie-2、TNF-a、ICAM-1、NF-κB、p38-MAPK蛋白的表達量;RT-PCR 法檢測 VEGF、p38-MAPK、miR-200b、miR-146a 基因的表達。(4)采用HE染色觀察各組大鼠胰腺組織病理學(xué)改變;采用免疫組化染色法檢測胰島素、胰高血糖素在胰腺的表達;Western blot檢測IRS-1蛋白在胰腺的表達。研究結(jié)果:1.對一般狀態(tài)、體重、血糖及視網(wǎng)膜病理的影響:(1)成模后4周開始,DM大鼠的體重與正常組相比明顯減輕,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。中藥組和西藥組大鼠體重與DM模型組相比明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與正常組相比,DM組大鼠各時間點隨機血糖顯著升高(P0.05);而DM模型組、中藥組、西藥組大鼠隨機血糖無顯著差異(P0.05)。DM大鼠發(fā)病12周后晶狀體渾濁情況:雙側(cè)混濁率(96%),無混濁率(4%);正常組大鼠晶狀體無混濁現(xiàn)象。(2)DM3月視網(wǎng)膜HE染色:正常組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰;DM模型組視網(wǎng)膜組織輕微水腫,各層細胞界限模糊,節(jié)細胞減少;中藥組和西藥組視網(wǎng)膜各層排列較整齊,有輕微組織水腫,未見毛細血管擴張。DM6月視網(wǎng)膜HE染色:DM模型組的視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)不清晰,節(jié)細胞減少,有空泡形成;內(nèi)核層細胞明顯排列紊亂,周圍水腫更明顯,毛細血管明顯擴張。中藥組和西藥組視網(wǎng)膜輕微水腫,細胞排列紊亂,可見內(nèi)皮細胞增生。(3)DM3月視網(wǎng)膜消化鋪片:正常組毛細血管分布規(guī)則,走向較直,血管徑粗細均勻;DM模型組毛細血管網(wǎng)排列紊亂,基底膜部分略增厚,周細胞減少,內(nèi)皮細胞開始增生;中藥組及西藥組血管鋪片表現(xiàn)接近正常組,毛細血管分布較規(guī)則,周細胞、內(nèi)皮細胞分布排列基本規(guī)律。DM6月視網(wǎng)膜消化鋪片:DM模型組毛細血管分布紊亂,有扭曲聚集等現(xiàn)象,部分毛細血管擴張,并可見微血管瘤、影周細胞、無細胞毛細血管散在分布。中藥組的視網(wǎng)膜毛細血管得到明顯的保護,未見扭曲聚集現(xiàn)象,毛細血管輕微擴張,內(nèi)皮細胞、周細胞分布排列比較規(guī)律;西藥組對視網(wǎng)膜的保護作用不如中藥組。(4)眼底照相和血管熒光造影提示:SD大鼠受到迅速的渦靜脈和脈絡(luò)膜血管的背景熒光干擾,視網(wǎng)膜血管顯影不清晰;正常BN組大鼠毛細血管清晰;而DM6周的BN大鼠,血管熒光造影均出現(xiàn)靜脈迂曲、微動脈瘤、熒光素滲漏等病理表現(xiàn)。2.對血——視網(wǎng)膜屏障保護的影響:(1)DM3月的模型組SD大鼠伊文思藍(EB)滲漏量與正常組比明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);中藥組和西藥組的EB滲漏量明顯降低,與正常組比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)DM模型組大鼠視網(wǎng)膜ZO-1、Occludin以及Claudin-5的表達量較正常組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與DM模型組相比,中藥組視網(wǎng)膜組織ZO-1表達量明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而西藥組ZO-1表達有升高趨勢,但無顯著性差異(P0.05);中藥組和西藥組視網(wǎng)膜組織Occludin表達明顯升高,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);西藥組視網(wǎng)膜組織Claudin-5表達量明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而中藥組Claudin-5表達有升高趨勢,但無顯著性差異(P0.05)。3.對改善血管內(nèi)皮功能的作用機理:(1)TUNEL檢測顯示DM模型組大鼠凋亡的視網(wǎng)膜細胞比正常組明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);中藥組和西藥組大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡細胞較DM組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)DM模型組視網(wǎng)膜VEGF和VEGFR表達量與正常組相比明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與DM模型組相比,中藥組與西藥組VEGF表達量明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與DM模型組相比,中藥組和西藥組VEGFR表達量均有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)DM模型組視網(wǎng)膜組織PEDF表達量與正常組比明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);中藥組視網(wǎng)膜PEDF表達量比DM模型組明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);西藥組PEDF表達量比模型組有上升趨勢,但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(4)與正常組比較,DM模型組Ang-1和Tie-2表達明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與DM模型組比較,中藥組Ang-1和Tie-2表達與模型組比明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);西藥組Ang-1和Tie-2表達有上升趨勢,但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(5)與正常組比較,DM模型組miR-200b的表達量與正常組比明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);中藥組和西藥組miR-200b相對表達量較DM模型組明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.對緩解炎癥狀態(tài)的作用機理:(1)DM模型組視網(wǎng)膜組織TNF-α和NF-κB的表達與正常組比明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);中藥組和西藥組NF-κB表達比模型組明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。中藥組和西藥組TNF-α表達與模型組比有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)與正常組比較,DM模型組的ICAM-1表達明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與DM模型組比較,中藥組和西藥組ICAM-1表達明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)與正常組比較,DM模型組p38-MAPK表達量與正常組比明顯升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與DM模型組相比,中藥組和西藥組p38-MAPK表達量明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(4)DM模型組microRNA-146a的表達量與正常組比明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);中藥組與西藥組的miR-146a的相對表達量較DM模型組有升高趨勢,但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5.對胰腺病理的影響:(1)DM3月胰腺HE染色:正常組大鼠胰島形態(tài)規(guī)則,為圓形或卵圓形的細胞團,胰島細胞數(shù)量較多,與外分泌腺界限清楚;DM模型組胰島形狀不規(guī)則,胰島細胞數(shù)量減少、分布稀疏;中藥組和西藥組:胰島形狀欠規(guī)則,胰島細胞數(shù)量減少,與外分泌腺界限相對清楚。DM6月胰腺HE染色:DM模型組胰島嚴重萎縮,胰島細胞數(shù)量嚴重減少、分布稀疏,外分泌腺向胰島內(nèi)入侵,胰島細胞腫脹,部分細胞核固縮、分裂。中藥組和西藥組胰島形狀欠規(guī)則,胰島萎縮,胰島細胞數(shù)量減少。(2)免疫組化結(jié)果顯示:與正常組比較,DM模型組大鼠胰島素染色陽性β細胞數(shù)量明顯降低(P0.05),胰高血糖素染色陽性α細胞數(shù)量明顯升高(P0.05);與模型組比較,中藥組能顯著升高胰島素染色陽性β細胞數(shù)量,降低胰高血糖素染色陽性α細胞數(shù)量(P0.05)。(3)DM模型組大鼠胰腺IRS-1的表達量較正常組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與模型組相比,中藥組和西藥組的IRS-1表達有升高趨勢,但無顯著性差異(P0.05)。研究結(jié)論:1.鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的SD大鼠糖尿病病程達12周時,大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)早期DR的病理改變;隨著糖尿病病程延長,視網(wǎng)膜病理改變逐漸加重。2.糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變發(fā)生前預(yù)防性給予益氣溫陽通絡(luò)方,可緩解大鼠DR的病理表現(xiàn),減少伊文思藍滲漏量,從而保護血—視網(wǎng)膜屏障,機制與增加緊密連接蛋白Occludin與ZO-1表達有關(guān)。3.益氣溫陽通絡(luò)方預(yù)防DR的機制可能通過調(diào)控miR-200b的表達,抑制VEGF表達,上調(diào)PEDF、Ang-1、Tie-2等關(guān)鍵靶基因的表達,從而改善視網(wǎng)膜內(nèi)皮功能障礙,預(yù)防DR的發(fā)生。4.益氣溫陽通絡(luò)方還可能通過調(diào)控NF-κB和p38-MAPK通路,降低ICAM-1的表達,同時降低TNF-α表達的趨勢,抑制炎癥狀態(tài),預(yù)防DR的發(fā)生。5.益氣溫陽通絡(luò)方可改善胰腺病理形態(tài),顯著增加胰島素陽性表達,減少胰高血糖素陽性表達,可能具有保護胰島功能的趨勢。
【圖文】：

Ｋka逡逑ｉ秦：滿逡逑圖２－２：邋ＮＰＤＲ的病理特征：主要癥狀是視網(wǎng)膜微動脈瘤，出血，和硬性滲出（Ａ和Ｂ）：和視網(wǎng)膜血逡逑管異常（Ｃ：箭頭）；靜脈串珠（Ｄ：箭頭）；靜脈環(huán)的形成（Ｅ：箭頭）。（引自：ＣｈｅｕｎｇＮ，邋ＭｉｔｃｈｅｌｌＰ．邋Ｗｏｎｇ逡逑ＴＹ．邋Ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．邋Ｌａｎｃｅｔ邋２０１０；邋３７６：１２４－３６．）逡逑＿＿逡逑欵ｉ逡逑圖２－３：邋ＰＤＲ的病理特征：ＰＤＲ的重要標志——新生血管形成（Ａ：箭頭），可通過眼底視網(wǎng)膜血管造逡逑２８逡逑

ＴＹ．邋Ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ．邋Ｌａｎｃｅｔ邋２０１０；邋３７６：１２４－３６．）逡逑＿＿逡逑欵ｉ逡逑圖２－３：邋ＰＤＲ的病理特征：ＰＤＲ的重要標志——新生血管形成（Ａ：箭頭），可通過眼底視網(wǎng)膜血管造逡逑２８逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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2 Wen-Ying Fan;Ning-Pu Liu;;Meta- analysis of association between K469E polymorphism of the ICAM-1 gene and retinopathy in type 2 diabetes[J];International Journal of Ophthalmology;2015年03期

3 寇馨云;金明;;糖尿病對血-視網(wǎng)膜屏障連接蛋白損傷機制研究進展[J];中國中醫(yī)眼科雜志;2015年02期

4 謝麗莉;;MicroRNA在糖尿病并發(fā)癥中的研究進展[J];實用檢驗醫(yī)師雜志;2015年01期

5 何潔;韓靜;郝改梅;吳晏;王偉;;糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管消化鋪片技術(shù)的改進及技巧探討[J];中國中醫(yī)眼科雜志;2015年01期

6 仝小林;;糖尿病血管并發(fā)癥中醫(yī)研究的策略[J];中國臨床醫(yī)生;2013年10期

7 李艷;李筱榮;袁佳琴;潘斌;;糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF、PEDF的表達與血-視網(wǎng)膜屏障損傷[J];眼科新進展;2013年01期

8 陸祖謙;丁維;;胰島β細胞功能衰竭在2型糖尿病發(fā)病機理中的作用及降糖藥物的選擇[J];藥學(xué)與臨床研究;2012年05期

9 康繼宏;寧光;吳家睿;管又飛;;中國糖尿病防治研究的現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)[J];轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究(電子版);2012年03期

10 仝小林;劉文科;王佳;倪青;魏軍平;;糖尿病郁熱虛損不同階段辨治要點及實踐應(yīng)用[J];吉林中醫(yī)藥;2012年05期

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1 王幫眾;益氣養(yǎng)陰化痰祛瘀方對2型糖尿病大鼠胰島β細胞的保護作用及機制[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

2 周小煦;大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變模型研究中眼底造影技術(shù)的改進[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號：2707451