【摘要】：目的:對人臍帶中間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUMSCs)進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定分析,采用黃芩苷定向誘導(dǎo),觀察其對hUMSCs的影響和效用,初步探討黃芩苷誘導(dǎo)hUMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用、條件及作用機(jī)制。方法:收集的新鮮臍帶來自于手術(shù)室足月剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦,用D-Hank’s液沖洗,去除臍帶動(dòng)脈和靜脈后,使用消毒器皿對其進(jìn)行剪切,形成大小約為1mm~3的組織塊,然后采用濃度為0.2%的膠原酶Ⅱ進(jìn)行消化。之后置入DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)液中加用主要藥物有:左旋谷氨酰胺(L-Glu,25 mM)、20%胎牛血清(FBS)、表皮細(xì)胞生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)2ng/ml,同時(shí),加入鏈霉素100μg/ml、青霉素100U/ml預(yù)防感染。觀察并詳細(xì)記錄所提取原代細(xì)胞的生長情況,當(dāng)細(xì)胞生長到融合率大約達(dá)80%密度時(shí),加入0.25%胰酶-1mM EDTA進(jìn)行消化和傳代。消化完成后,采取流式細(xì)胞術(shù)對首次消化后收集的細(xì)胞表型進(jìn)行檢測,這些細(xì)胞表型包括:CD45、CD90、CD34、CD105、CD11b、CD19、CD73以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-II),采用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對照。原代hUMSCs按比例1:1傳代,傳代后的細(xì)胞記作P1代,倒置顯微鏡下觀察增殖速度及細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí),按1:2或1:3比例傳代,繪制細(xì)胞生長曲線。選取培養(yǎng)P4代的hUMSCs為研究對象,根據(jù)給藥情況分為四組:25μg/ml組、50μg/ml組、100μg/ml組和對照組。采用事先準(zhǔn)備的以多聚賴氨酸包被的六孔板,按3×10~4/孔的密度將P4代細(xì)胞接種于4個(gè)六孔板中(每個(gè)六孔板為一組),待細(xì)胞生長達(dá)70%融合度時(shí),實(shí)驗(yàn)組的三個(gè)六孔板分別更換為含25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml黃芩苷的低糖無血清DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo);對照組為不含黃芩苷的相同培養(yǎng)基。于倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化,每12小時(shí)觀察一次,連續(xù)觀察7天。對各組細(xì)胞每24h進(jìn)行一次免疫細(xì)胞化學(xué)染色,檢測誘導(dǎo)細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記---Nestin、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記---膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神經(jīng)元標(biāo)記---神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)的表達(dá)情況。各組隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野,拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù),用以計(jì)算分化率,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。結(jié)果:原代細(xì)胞經(jīng)過消化、傳代,培養(yǎng)12h時(shí),我們發(fā)現(xiàn),大部分細(xì)胞呈貼壁生長,細(xì)胞形態(tài)可為三角形、橢圓形、菱形或圓點(diǎn)狀;隨著培養(yǎng)時(shí)間的遞增,細(xì)胞形態(tài)逐漸衍生為梭形;培養(yǎng)7-8d后細(xì)胞倍增達(dá)85%以上融合度時(shí),低倍鏡下可觀察到hUMSCs呈放射狀或漩渦狀排列。隨后按1:2的比例進(jìn)行傳代,發(fā)現(xiàn)P15代的hUMSCs仍能呈現(xiàn)旺盛的生長增殖能力。對P2、P5和P8細(xì)胞,細(xì)胞表面標(biāo)記物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:CD90、CD105和CD73均陽性表達(dá),CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR均不表達(dá)。加入不同濃度黃芩苷誘導(dǎo)液24h后,100μg/ml組顯微鏡下可以看到個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)了形態(tài)改變:胞體收縮,細(xì)胞變圓,折光度增加;而50μg/ml組和25μg/ml組六孔板內(nèi)細(xì)胞未見明顯形態(tài)學(xué)改變;隨著誘導(dǎo)時(shí)間的逐漸延長,發(fā)生形態(tài)改變的細(xì)胞胞體進(jìn)一步收縮;48h后部分細(xì)胞伸出指狀突起;72h后100μg/ml組可見細(xì)胞突起增長并形成雙極樣突觸,50μg/ml組也開始出現(xiàn)折光度增強(qiáng)的類似改變,而25μg/ml組細(xì)胞形態(tài)始終未見明顯改變;誘導(dǎo)96h時(shí),100μg/ml組形態(tài)改變的細(xì)胞突起較前更加細(xì)長,并可多達(dá)2至5條,折光度進(jìn)一步增強(qiáng),呈典型神經(jīng)樣細(xì)胞改變;50μg/ml組細(xì)胞也開始形成突觸樣類神經(jīng)細(xì)胞,25μg/ml組細(xì)胞形態(tài)依然未見明顯變化;誘導(dǎo)120h時(shí),100μg/ml組神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量明顯增多,50μg/ml組內(nèi)變化呈類似趨勢,6d后100μg/ml組、50μg/ml組形態(tài)變化細(xì)胞數(shù)未見繼續(xù)增多,25μg/ml組僅出現(xiàn)折光度增強(qiáng)細(xì)胞,7d時(shí)100μg/ml組、50μg/ml組神經(jīng)樣變化的細(xì)胞可見漂浮死亡現(xiàn)象,神經(jīng)樣細(xì)胞比例下降,25μg/ml組僅出現(xiàn)少量帶突起神經(jīng)樣細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見神經(jīng)樣細(xì)胞陽性表達(dá)Nestin、GFAP和NSE。在不同藥物濃度作用下,各標(biāo)志物陽性表達(dá)率隨時(shí)間的變化依次為:100μg/ml組(0.0±0.0、1.9±0.9、8.5±0.6、11.0±0.5、16.4±0.5、16.3±0.6、11.5±0.6);50μg/ml組(0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、2.1±0.2、6.7±0.7、10.1±0.4、8.1±0.5);25μg/ml(0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0、0.0±0.0)。對照組免疫細(xì)胞化學(xué)呈陰性。結(jié)論:1.從人臍帶分離得到的hUMSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD73、CD90和CD105,而不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45、CD19、CD11b和組織相容性抗原HLA-DA(MHC-Ⅱ)。具有干細(xì)胞特性�？勺鳛樯窠�(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞移植的細(xì)胞來源。2.從人臍帶中分離純化得到的hUMSCs可在體外穩(wěn)定傳代,并保持較高活性。3.黃芩苷在一定濃度下可體外誘導(dǎo)hUMSCs分化成神經(jīng)樣細(xì)胞,并表達(dá)神經(jīng)元表面標(biāo)志物NSE和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP以及神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin。
【圖文】：

圖 1 在倒置顯微鏡下觀察的原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（x40）Fig.1 Photographs of the original culture of hUMSCs were observed under aninverted microscope. Zoom in: 40 XNote:A. After 12 hours of cultivation, hUMSCs showed diamond, triangle,oval, dot and other forms.B. After 3 days of cultivation, the long axis is one.C.After 7 days of culture, hUMSCs had fused about 90 % and arranged radially

圖 2 5 天后在顯微鏡下觀察不同濃度組培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（x200）Fig.2 hUMSCs of different dosage groups was observed by reversemicroscope on the 5th day after differentiation culture. Zoom in: 200 XNote:A. 100μg/ml group; B. 50μg/ml group; C. 25μg/ml group; D. 0μg/ml-control group
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

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10 嚴(yán)s，

本文編號(hào)：2706828