【摘要】：白念珠菌是一類普遍的寄生真菌,過度繁殖可以導(dǎo)致人體淺表皮膚、粘膜感染,嚴重時可引起肺炎、腦膜炎等深部感染。國內(nèi)外文獻報道白念珠菌對氟康唑的耐藥性不斷增強,耐藥白念珠菌嚴重威脅人體健康。因此,研究新型抗耐藥白念珠菌的藥物具有重大臨床意義。植物中分離出的天然產(chǎn)物來源廣泛,結(jié)構(gòu)簡單,毒性低,活性強,對研發(fā)新型藥物具有重要意義。本課題基于前期實驗發(fā)現(xiàn),天然化合物芒果苷和魚腥草素鈉單獨作用都具有一定抗菌活性,但抑菌濃度太高。因此,本課題重點研究芒果苷和魚腥草素鈉在較低濃度下協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌的作用,并對機制進行探索。本研究第一部分探索了芒果苷與氟康唑聯(lián)用抗耐藥白念珠菌的作用和機制。實驗首先采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對實驗室的24株臨床白念珠菌進行鑒定,確保實驗可靠性。應(yīng)用棋盤式微量稀釋法、生長抑制實驗、時間-生長曲線實驗、時間-殺菌曲線實驗進行多次重復(fù)驗證,確定芒果苷與氟康唑合用對耐藥白念珠菌抑制作用的普遍性和廣泛性。通過建立小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型,研究氟康唑和芒果苷聯(lián)用體內(nèi)抗菌藥效,結(jié)果表明兩藥合用不能明顯提高生存率,但可以延長模型小鼠的平均生存天數(shù)。本課題進一步real-time RT-PCR方法,研究芒果苷與氟康唑協(xié)同抗菌的作用機制。結(jié)果顯示,,兩藥合用使耐藥基因表達水平下調(diào),CDR1下調(diào)幅度最大。提示芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌分子機制可能與抑制耐藥蛋白(Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p)轉(zhuǎn)運功能,迫使白念珠菌對藥物的敏感性升高有關(guān)。本課題第二部分探究魚腥草素鈉與氟康唑聯(lián)用抗耐藥白念珠菌的作用和機制。本研究首先應(yīng)用棋盤式微量稀釋法證明魚腥草素鈉與唑類抗菌藥物具有協(xié)同抗菌活性,進一步應(yīng)用紙片擴散實驗法、棋盤式微量稀釋法、時間-生長曲線實驗、時間-殺菌曲線實驗,研究魚腥草素鈉與氟康唑合用對浮游白念珠菌的抑制作用。結(jié)果表明,兩藥合用對白念珠菌具有明顯抑制作用和殺菌作用。實驗進一步通過菌絲抑制實驗、XTT法測定被膜形成率實驗、熒光顯微鏡觀察被膜和相對疏水性實驗研究了魚腥草素鈉與氟康唑合用對被模型白念珠菌的抑制作用。結(jié)果顯示,兩藥合用可以明顯抑制菌絲形成、降低被膜形成率、降低細胞表面疏水性,抑菌藥效和藥物作用濃度呈正比。實驗進一步通過建立小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型、大鼠體內(nèi)生物被膜模型,探究兩藥聯(lián)合抗體內(nèi)系統(tǒng)性真菌感染和抗生物被膜形成的作用。結(jié)果顯示,魚腥草素鈉與氟康唑聯(lián)用可以有效降低系統(tǒng)性真菌感染小鼠死亡率,延長生存天數(shù),并能夠抑制體內(nèi)菌絲和生物被膜形成。課題進一步對魚腥草素鈉協(xié)同氟康唑抑菌的機制進行了實驗探索。通過活性氧實驗、胞內(nèi)ATP水平測定,表明藥物協(xié)同機制或與降低細胞代謝水平,抑制ATP產(chǎn)生有關(guān)。采用免疫熒光法觀察實驗藥物聯(lián)用前后對細胞壁成分的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩藥合用后細胞體積變大,呈“串珠”狀,且細胞壁中葡聚糖暴露熒光減弱。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示8μg/m L魚腥草素鈉與4μg/mL氟康唑合用后,84.46%細胞喪失了選擇通透能力。本研究最后采用real time RT-PCR方法檢測兩藥合用對耐藥基因表達水平的影響。結(jié)果顯示,兩藥合用可選擇性抑制藥物耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1、FLU1表達。因此,魚腥草素鈉和氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌機制作用可能與降低細胞代謝水平、降低耐藥基因表達水平、破壞細胞壁和使細胞膜喪失選擇通透能力有關(guān)。本課題第三部分通過同位素標記相對和絕對定量方法(iTRAQ)研究魚腥草素鈉協(xié)同氟康唑抗白念珠菌機制,通過iTRAQ方法共鑒定出2333個蛋白質(zhì),兩藥合用組共檢測出150個可信差異蛋白,排除氟康唑、魚腥草素鈉單獨作用差異蛋白,經(jīng)數(shù)據(jù)庫對比分析發(fā)現(xiàn)有34個蛋白質(zhì)已確定生物學(xué)功能。對差異蛋白分類進行生物學(xué)功能分析,發(fā)現(xiàn)兩藥合用使能量代謝蛋白表達升高(ACO1p、HXK2p、KGD1p、ACS2p),催化β-1,3葡聚糖合成蛋白(FKS1p)表達降低,促進β-1,3葡聚糖分解蛋白(XOG1p、ENG1p)升高,提示兩藥協(xié)同抗白念珠菌作用機制可能與調(diào)節(jié)β-1,3葡聚糖合成分解、破壞細胞壁完整性有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2706600