【摘要】：目的:本專題借助國家自然科學(xué)基金和國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制項目資助,擬以射干藥材為研究對象,通過古典醫(yī)籍考證及現(xiàn)代文獻資料,初步確定藥材功能主治及臨床適用病癥;利用臨床驗證試驗明確適用病癥篩選的準確性;采用動物實驗,探索藥物對篩選病癥的初步作用模式;依靠分子對接技術(shù),預(yù)測藥材活性組分與體內(nèi)受體蛋白靶點之間的結(jié)合模式和親和力,模擬藥物可能的作用機制;采取模型動物實驗,選擇模擬篩選的作用靶點為測定指標,從蛋白表達、體內(nèi)生物標記物變化方面對所預(yù)測的機制進行試驗驗證,確定藥物治療疾病多成分、多途徑、多靶點作用機制,探討建立中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的新方法及新技術(shù)可行性。材料與方法:1.通過查閱春秋戰(zhàn)國至明清時期的古典醫(yī)籍,結(jié)合射干古代方劑配伍應(yīng)用考察分析,對射干及其組方在不同歷史時期功能主治、適用病種及性味歸經(jīng)進行歸納,明確了射干應(yīng)用的演變過程。利用《普濟方》數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng),對射干跨病種檢索,可得含射干復(fù)方在治療所有疾病的分布情況,并與歷代本草學(xué)和《中華人民共和國藥典》記載的功能主治相比較�；诂F(xiàn)代文獻學(xué)研究,對射干現(xiàn)代藥理作用進行歸納整理。依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論,對射干最佳治療適應(yīng)癥型進行分析。2.在前期文獻研究確立射干藥材臨床適應(yīng)證型基礎(chǔ)上,通過設(shè)計基于臨床適應(yīng)病癥-急性支氣管炎及感染后咳嗽的臨床驗證試驗方案,在經(jīng)過遼寧省藥品監(jiān)督管理局審批及醫(yī)院倫理委員會討論通過后,采用隨機、雙盲、對照試驗的方法對射干藥材臨床應(yīng)用最佳病癥進行篩選研究。臨床評價試驗選擇感染后咳嗽(治療組和陽性藥對照組)、急性氣管-支氣管炎病癥(治療組和陽性藥對照組),以肺寧片(返魂草制劑)作為陽性對照藥,按1:1的比例安排病例數(shù)。其中臨床評價試驗例數(shù)為:感染后咳嗽組為每組40例,急性氣管-支氣管炎組為每組60例,共200例。急性氣管-支氣管炎和感染后咳嗽各兩組病例在性別、年齡、病程及病情輕重上經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,差異無顯著意義(P0.05),具有可比性。治療組給予射干制劑,1.2g/次(3次/日);對照組給予肺寧片,5片/次(3次/日);療程為10天。所有病例均符合診斷標準,不符合排除標準。分別對治療前后患者日間咳嗽評分、夜間咳嗽評分、咳痰情況、痰量評分、白細胞計數(shù)評分、中性粒細胞計數(shù)評分及淋巴細胞百分比評分進行測定。采用SPSS統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行配對T檢驗。3.根據(jù)兩個證型臨床驗證試驗結(jié)果,考慮感染后咳嗽在患病人群中更為常見,患者量較大,且在臨床上沒有較為有效的治療手段,因此選擇其作為射干藥材作用機制研究的方向。實驗選取40只SPF級豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機分為4組,分別為空白組、模型組、射干提取物組(600 mg/kg/天),中藥陽性(肺寧片512 mg/kg/天)對照組,每組10只。采用煙熏、RSV滴鼻、枸櫞酸霧化誘咳,建立豚鼠合胞病毒感染后咳嗽模型。造模后,除模型組外,其它各給藥組在第8天時開始給藥,連續(xù)給藥7天,空白組給予等體積生理鹽水。末次給藥后45 min,將實驗豚鼠用2%戊巴比妥(25 mg/kg)麻醉后仰臥固定于操作臺,采集血液及肺組織等實驗研究用樣本。觀察模型動物給藥前后白細胞總數(shù)及分類計數(shù)變化;HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化;觀察治療前后咳嗽次數(shù)的變化;采用HPLC-MS測定肺組織中花生四烯酸含量的變化。4.從花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)的多靶標藥物研究思路出發(fā),利用分子對接的技術(shù),借助虛擬篩選手段,對射干抗炎可能的作用靶點進行預(yù)測(基于分子對接技術(shù),)。通過國內(nèi)外文獻檢索及TCMSP數(shù)據(jù)庫,歸納了已報道的分子結(jié)構(gòu)明確的50個射干異黃酮類化合物;利用PDB數(shù)據(jù)庫下載獲得了與花生四烯酸代謝途徑相關(guān)PLA2、COX-1、COX-2、5-LOX、LTA4H、CYP450蛋白結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處理和配體結(jié)構(gòu)構(gòu)建選用Sybyl6.91軟件包,分子對接研究由Auto Dock 4.02軟件完成,并由Discovery Studio Visuliazer 4.0軟件包觀察結(jié)果。從晶體結(jié)構(gòu)中提取共結(jié)晶配體作為對照分子,以相對分值(R=化合物分值/對照分子分值)來比較化合物與靶點的作用強度。將射干中50個異黃酮類化學(xué)成分與花生四烯酸3條通路上的7個主要蛋白靶點PLA2、COX-1、COX-2、5-LOX、LTA4H、CYP450(2vn0、5a5i)分別進行分子對接,根據(jù)評分結(jié)果模擬射干藥材抗炎作用機制。5.根據(jù)分子對接相對應(yīng)的分值(R)結(jié)果,模擬出射干藥材可能通過抑制COX-2、5-LOX和CYP450等信號通路發(fā)揮多途徑、多靶點抗炎作用。驗證實驗采用Western-blot法檢測模型動物豚鼠給藥后肺組織中COX-2和5-LOX蛋白表達水平;采用蛋白試劑盒提取肺組織中蛋白,并采用BCA法檢測蛋白濃度。根據(jù)待測靶標蛋白分子量確定分離膠濃度。采用HPLC-MS-MS法;格列本脲(DHDT系列)和PGB1(PGs和HETE系列)為內(nèi)標物;乙酸乙酯提取,合并上清液,氮氣吹干,100μL甲醇溶解,13500 r/min離心5 min后,吸取上清液作為供試品溶液;10 mmol/L醋酸銨水溶液(A):甲醇(B)0-15 min,52-68%B為流動相,流量0.3 ml/min,柱溫40℃,進樣量5μL檢測花生四烯酸COX通路代謝產(chǎn)物TXB2、PGD2、PGE2;水(A)—乙腈(B)48:52為流動相,流量0.3 ml/min,柱溫40℃,進樣量5μL檢測CYP通路代謝產(chǎn)物8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET;水(A)—乙腈(B)38:62,柱溫30℃,流量0.3 ml/min,進樣量5μL檢測LOX通路代謝產(chǎn)物5HETE、15HETE的變化,明確射干藥材抗炎作用機制。結(jié)果:1.射干功能主治本草考證研究結(jié)果表明,射干始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,從古至今為治療咽喉腫痛及痰多咳喘的常用藥,具有清熱解毒、宣肺化痰功能,用于治療咳嗽、發(fā)熱、口渴、咯痰等病癥�；凇镀諠健窋�(shù)據(jù)庫古方配伍應(yīng)用考證結(jié)果表明,含射干復(fù)方所治疾病以喉痹咽痛、咳嗽、咳喘、咽干、痰熱壅盛諸病與2015年版《藥典》一部所記功能主治完全吻合。所治腳氣、調(diào)經(jīng)等作用,《藥典》一部則未收錄。現(xiàn)代文獻學(xué)研究表明,射干具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等藥理作用。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論研究結(jié)果,考慮急性氣管-支氣管炎(風邪犯肺證)及感染后咳嗽(余熱未清證)在炎性表現(xiàn)方面一急一慢,發(fā)病方面風熱犯肺表現(xiàn)在前期,后期入里化熱、余熱未清,頗具代表性,故選擇此二證為射干臨床應(yīng)用試驗病征。2.基于射干藥材最佳臨床適應(yīng)病種的急性氣管-支氣管炎和感染后咳嗽臨床評價結(jié)果表明:從日間咳嗽評分、夜間咳嗽評分、咳痰情況、痰量評分、白細胞計數(shù)評分、中性粒細胞計數(shù)評分及淋巴細胞百分比評分方面,射干制劑均有良好效果。雖然與對照藥肺寧片比無顯著性差異,但射干制劑治療組相關(guān)指標優(yōu)于肺寧片組。提示基于傳統(tǒng)文獻與現(xiàn)代文獻研究的臨床最佳病種選擇這一中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究思路具有一定的可行性。3.在射干制劑臨床應(yīng)用最佳病種篩選基礎(chǔ)上,選擇病毒感染后咳嗽動物模型作為藥物初步作用模式研究的動物模型。體內(nèi)動物實驗結(jié)果表明,復(fù)制RSV感染豚鼠咳嗽模型,通過檢測豚鼠肺組織勻漿能引起Hep-2細胞病變,證實合胞病毒感染成功;肺組織病理學(xué)檢查支持氣道炎癥改變明顯,而肺實質(zhì)炎癥無明顯改變;模型動物組血清中,白細胞總數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、單核計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)及嗜酸粒細胞計數(shù)與空白組相比,均無顯著差異;動物模型組5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著高于空白組。干預(yù)藥物射干制劑組能明顯抑制模型動物5 min內(nèi)咳嗽次數(shù),減輕肺組織中支氣管和周圍炎癥,降低肺組織中花生四烯酸含量。據(jù)此推測,射干藥材通過干預(yù)花生四烯酸炎癥代謝網(wǎng)絡(luò)達到抗炎、止咳作用。4.模型動物藥效學(xué)評價及作用機制實驗結(jié)果表明射干藥材的抗炎作用與花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)。因此,通過分子對接技術(shù),利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及分子對接軟件,分別模擬了射干藥材所含50個黃酮類化合物的分子量、氫鍵給體、氫鍵受體及脂水分配系數(shù),結(jié)果表明射干黃酮類化合物符合“Lipinski”類藥性規(guī)則,表明射干黃酮具有良好的類藥性。射干黃酮成分與花生四烯酸代謝通路七個抗炎靶點的打分值依次為:COX-2㧐5-LOX㧐COX-1㧐CYP450(5a5i)㧐PLA2㧐LTA4H㧐CYP450(2vn0),其中射干黃酮成分與COX-2對接結(jié)果最好,50個化合物的結(jié)合常數(shù)均大于對照分子。與5-LOX和COX-1對接結(jié)果較好,R值均大于0.8。與CYP450(5a5i)亞型分子對接的相對分值也較好,有43個化合物的分值≥0.8,。表明射干藥材所含黃酮類成分可能通過多成分、多途徑、多靶點發(fā)揮抗炎、止咳作用,其作用途徑可能與COX、5-LOX及CYP450有關(guān)。5.基于分子對接模擬實驗結(jié)果,用Western-blot檢測模型動物豚鼠肺組織中COX-2和5-LOX蛋白表達水平。WB實驗結(jié)果表明,與正常對照組比較,模型組COX-2、5-LOX蛋白表達水平顯著升高(P0.05),說明所建立合胞病毒感染豚鼠咳嗽模型可激活花生四烯酸代謝COX-2和5-LOX信號通路,使得致炎性花生四烯酸代謝產(chǎn)物大量生成。射干提取物組COX-2蛋白表達水平顯著降低(P0.05),而5-LOX蛋白表達無顯著降低(P0.05),提示射干藥材可能通過抑制花生四烯酸COX-2代謝途徑,減少致炎性代謝產(chǎn)物的生成�；ㄉ南┧岽x產(chǎn)物含量測定結(jié)果表明:在COX代謝途徑研究中,應(yīng)用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法測定了其信號通路代謝產(chǎn)物PGD2、TXB2、11HETE和PGE2的含量。與正常對照組比較,模型組肺組織中PGD2、TXB2、11HETE含量顯著升高(P0.05),給予射干提取物后各代謝產(chǎn)物含量均下降(P0.05)。結(jié)合蛋白印跡結(jié)果,推測射干提取物可能是通過抑制COX2表達,降低代謝產(chǎn)物PGD2、TXB2、11HETE的釋放,減緩炎癥的進程。在LOX代謝途徑研究中,應(yīng)用液相-質(zhì)譜聯(lián)用法測定了其信號通路代謝產(chǎn)物5HETE和15HETE的含量。實驗結(jié)果表明,與正常對照組比較,模型組肺組織中5HETE和15HETE含量顯著升高(P0.05),說明所建立豚鼠感染后咳嗽模型可激活A(yù)A代謝LOX途徑,使得致炎性AA代謝產(chǎn)物5HETE和15HETE大量生成。給予射干提取物后各代謝產(chǎn)物含量有降低趨勢,但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合蛋白印跡結(jié)果,推測射干提取物對LOX及其代謝產(chǎn)物的抑制作用不明顯。在CYP450途徑中,測定了代謝產(chǎn)物8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET和16HETE的含量。與正常對照組比較,模型組肺組織中16HETE含量顯著升高(P0.05),給予射干提取物后16HETE含量有降低趨勢,但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。但是給藥組的11,12-DHET、14,15-DHET含量顯著降低(P0.05)。推測射干提取物能影響CYP表氧化酶途徑生成11,12-DHET、14,15-DHET。結(jié)論:1.射干從古至今為治療咽喉腫痛及痰多咳喘的常用藥,通過古典醫(yī)籍考證及現(xiàn)代藥理研究,具有清熱解毒、宣肺化痰之功效,推測射干適合治療風熱病邪引起的病癥,主要包括余熱未清證和風熱犯肺證。2.射干制劑在治療感染后咳嗽及急性氣管-支氣管炎具有很好臨床療效,表明基于古典醫(yī)籍和現(xiàn)代文獻確定藥物治療病種這一中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)思路具有一定的可行性。3.采用RSV感染豚鼠可以成功復(fù)制病毒感染咳嗽模型;中藥射干提取物能明顯抑制模型動物咳嗽次數(shù),減輕肺組織炎癥,降低肺組織中花生四烯酸含量,表明射干藥材通過干預(yù)花生四烯酸炎癥通路發(fā)揮抗炎、止咳作用。4.基于射干藥材活性組分的分子對接模擬實驗結(jié)果表明:射干黃酮類成分干預(yù)花生四烯酸炎癥通路達到抗炎作用途徑可能與COX和5-LOX靶點相關(guān);射干藥材與花生四烯酸代謝通路七個抗炎靶點的對接結(jié)合自由能依次為:COX-2㧐5-LOX㧐COX-1㧐CYP450(5a5i)㧐PLA2㧐LTA4H㧐CYP450(2vn0)。5.射干活性組分分子對接驗證實驗結(jié)果表明:射干藥材主要通過干預(yù)花生四烯酸COX-2、CYP450信號通路達到抗炎、止咳作用。6.通過本專題研究,基于分子對接技術(shù)探討中藥作用機制進而開展轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究具有一定的可行性,其能夠較早的提示或確定中藥多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮療效的作用機制及靶點。但是中藥成分復(fù)雜,多成分協(xié)同作用所產(chǎn)生的增效減毒或減效增毒作用可能影響其模擬的準確性,引起實驗偏差,所以在研究中應(yīng)該適當增加相應(yīng)考察指標。
【圖文】：

2.7.5 射干提取物對實驗動物肺組織中花生四烯酸（AA）的影響取豚鼠肺組織樣品約 0.1g，生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，加 10 倍量 PBS，勻漿，離心（6500 r/min，50s）。取上清液 100μL，加入內(nèi)標 Ad8 溶液 5 μL，渦旋混合均勻，加乙酸乙酯 1mL，離心（14000 r，10 min），吸出有機相，水相再提取一次，合并乙酸乙酯溶液，氮氣吹干，殘留物用 100 μL 甲醇溶解，作為 AA供試品溶液。測定條件：流動相：水（A）—乙腈（B）15:85；監(jiān)測離子為 AA，內(nèi)標為AA-d8，色譜柱：Poroshell120，EC-C18(3.0×100 mm，2.7 μm，Agilent)；流動相：10 mmol/L 醋酸銨水溶液（A）：甲醇（B）0-15 min，52-68%B；流量 0.3 ml/min；柱溫：40℃；進樣量：5 μL。質(zhì)譜條件：ESI 離子源；Gas Flow 8 L/ml，Gas Temp 350 ℃，Nebulizer 40 psi，Capillary 4000 V；負離子方式檢測，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

基于分子對接的射干抗氣道炎癥機制研究析及 LSD 檢驗。實驗結(jié)果3 結(jié)果3.1 RSV 感染后病毒學(xué)檢測結(jié)果除空白組外，各組的肺組織均漿液在 Hep-2 細胞上培養(yǎng)至第 2 天細胞開始逐漸腫脹、變圓和聚集，，細胞間隙增大，第 4 天形成多核巨細胞或稱融合細胞。提示 RSV 病毒感染成功。見圖 3-2。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2706163