【摘要】：目的:為研發(fā)安全、有效和機(jī)制明確的可替代ICS的新型抗AECOPD氣道炎癥的天然藥物,并提供藥理毒理學(xué)的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持,本論文擬通過(guò)構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞THP-1炎癥模型,體外觀察獨(dú)活中天然活性成分二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯(CBN)對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用;結(jié)合PCR Array、基因沉默與過(guò)表達(dá)、分子對(duì)接技術(shù)篩選及驗(yàn)證CBN對(duì)炎癥相關(guān)基因通路的影響;然后通過(guò)CBN對(duì)小鼠灌胃給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察其毒性反應(yīng);進(jìn)一步通過(guò)建立NTHi誘導(dǎo)的小鼠AECOPD模型,觀察CBN的抗AECOPD作用;結(jié)合代謝組學(xué)等手段探討CBN抗AECOPD的機(jī)制。方法:1、CBN對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥模型的作用(1)LPS刺激THP-1細(xì)胞,體外模擬細(xì)菌感染狀態(tài),建立LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥模型,利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbant assay,ELISA)分別測(cè)定低劑量(30μg/mL)、中劑量(50μg/mL)和高劑量(100μg/mL)CBN對(duì)炎癥細(xì)胞模型中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)分泌的影響。(2)以PCR Array篩選和分析受CBN影響的差異表達(dá)炎癥相關(guān)基因;結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)篩選差異表達(dá)基因富集程度最高的基因通路;qP CR檢測(cè)篩選出的基因通路中關(guān)鍵基因表達(dá)情況,驗(yàn)證CBN對(duì)其調(diào)節(jié)作用。2、CBN通過(guò)NOD1抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥狀態(tài)分別將NOD1的siRNA或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1轉(zhuǎn)染入THP-1細(xì)胞,qP CR檢測(cè)NOD1基因表達(dá)水平以判定轉(zhuǎn)染效率;采用qP CR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞炎癥模型中CBN作用后的NOD1、RIP2和NF-κB P65 mRNA和蛋白表達(dá)水平;ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β和MCP-1表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。3、CBN對(duì)AECOPD模型小鼠的作用研究(1)CBN小鼠灌胃給藥急性毒性試驗(yàn)灌胃給藥2次。單次給藥劑量為2500mg/kg,總給藥劑量為5000 mg/kg。給藥后1小時(shí)和4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行觀察,此后14天每天進(jìn)行一次觀察。第0、3、7和14天稱(chēng)量體重,觀察期末對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行大體解剖。(2)CBN對(duì)AECOPD小鼠模型肺功能的影響煙霧刺激16周建立小鼠COPD模型,煙霧刺激第15周末時(shí)氣管內(nèi)注射N(xiāo)THi 108 CFU/mL,建立小鼠AECOPD模型。隨后灌胃給予CBN(50、100和200 mg/kg)7天,小動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)小鼠肺功能:第0.1秒呼出的氣體(Forced Expiration Volume in 100ms,FEV0.1)、肺功能殘氣量(Functuional Residual Capacity,FRC)和氣道阻力(Airway Resistance,RI);(3)CBN抗AECOPD作用的機(jī)制流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CBN作用前后BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量變化;HE染色檢測(cè)肺組織炎癥浸潤(rùn)程度;ELISA檢測(cè)BALF中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的表達(dá)量。采用qP CR、Western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺組織中NOD1、RIP2和NF-κB P65基因和蛋白表達(dá)水平的變化,同時(shí)利用分子對(duì)接手段,模擬CBN與受體蛋白的結(jié)合模式與親合力。4、代謝組學(xué)技術(shù)研究CBN對(duì)AECOPD小鼠血清代謝物的影響CBN干預(yù)AECOPD小鼠的血清樣本非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究利用藥物代謝組學(xué)研究手段,采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)結(jié)合與多元統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)正常組、AECOPD模型組小鼠以及CBN高劑量組小鼠血清中小分子內(nèi)源性代謝物及相關(guān)代謝途徑進(jìn)行研究,進(jìn)一步從整體水平闡明CBN的可能作用機(jī)制。結(jié)果:1、CBN對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥模型的作用及差異表達(dá)基因的篩選(1)3個(gè)劑量組的CBN處理LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞后,TNF-α,IL-1β和MCP-1等促炎性細(xì)胞因子的分泌顯著減少(p0.01),提示CBN在體外具較好的抗炎作用。(2)PCR Array分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)CBN作用后,LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因46個(gè),且主要集中在NOD1/NF-κB通路上,提示CBN可能是通過(guò)影響該通路進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎作用。2、CBN通過(guò)NOD1抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥狀態(tài)建立了NOD1基因沉默和過(guò)表達(dá)的THP-1細(xì)胞模型;當(dāng)NOD1基因沉默后,50μg/mL CBN對(duì)RIP2和NF-κB P65表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用降低或消失(p0.1),對(duì)細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和MCP-1水平的調(diào)節(jié)作用也減弱或消失(p0.1),CBN對(duì)LPS引起的THP-1細(xì)胞凋亡抑制作用減弱(p0.05);NOD1基因過(guò)表達(dá)后,CBN可顯著降低LPS引起的THP-1細(xì)胞中RIP2和NF-κB P65表達(dá)水平(p0.01),同時(shí)降低了細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子的分泌水平(p0.01),LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡狀況也顯著被抑制(p0.01),證實(shí)CBN通過(guò)NOD1信號(hào)途徑發(fā)揮其抗炎作用。3、CBN對(duì)AECOPD模型小鼠的作用研究(1)CBN小鼠灌胃給藥急性毒性試驗(yàn):在本試驗(yàn)條件下,CBN以2500 mg/kg的劑量對(duì)小鼠1日內(nèi)灌胃給藥2次,觀察14天,未見(jiàn)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng),其半數(shù)致死劑量大于5000 mg/kg。(2)CBN對(duì)AECOPD小鼠模型肺功能的影響:AECOPD小鼠FEV0.1較正常組顯著降低,FRC及RI均較正常組顯著升高,經(jīng)CBN作用后均下降;(3)CBN抗AECOPD作用的機(jī)制:肺組織HE染色表明CBN可顯著抑制NTHi感染引起的肺組織炎癥狀況;小鼠BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著降低(p0.01),BALF中TNF-α,IL-1β和MCP-1的分泌水平也顯著降低(p0.01);肺組織中NOD1、RIP2和NF-κB P65基因和蛋白表達(dá)水平經(jīng)CBN作用后顯著降低(p0.01),提示CBN能夠抑制NTHi誘導(dǎo)的小鼠AECOPD,其作用可能是通過(guò)抑制NOD1-RIP2-NF-κB通路的活化,進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生,以及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)所介導(dǎo)的。另外,分子對(duì)接結(jié)果表明CBN能夠較好的嵌入RIP2受體的活性口袋,有較好的空間及電性互補(bǔ),與ASP-164氨基酸殘基形成1個(gè)氫鍵。4、代謝組學(xué)技術(shù)研究CBN對(duì)AECOPD小鼠血清代謝物的影響對(duì)CBN干預(yù)AECOPD小鼠的血清樣本非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究:與正常對(duì)照組小鼠比較,AECOPD模型小鼠血清中一些內(nèi)源性代謝物含量發(fā)生了明顯改變,CBN干預(yù)后可顯著回調(diào)α-酮戊二酸、檸檬酸、丙氨酸、5-HETE、谷氨酸、谷氨酰胺、白三烯A4、12,13-EpOME、棕櫚酸、16(R)-HETE、視黃酯、19(S)-HETE、油酸、二十二碳六烯酸、卵磷脂、花生四烯酸、亞油酸、20羥基-白三烯B4、維生素A等24種內(nèi)源性代謝物水平,提示CBN可能通過(guò)調(diào)控花生四烯酸代謝、谷氨酰胺代謝和D-谷氨酸代謝、亞油酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、視黃醇代謝以及三羧酸循環(huán)等代謝通路而發(fā)揮抗小鼠的AECOPD作用。結(jié)論:1、CBN能夠抑制AECOPD氣道炎癥,有效緩解小鼠肺功能,對(duì)AECOPD模型小鼠具有一定的治療作用;2、CBN對(duì)AECOPD模型小鼠的治療作用也與NOD1-RIP2-NF-κB通路活化及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)相關(guān);3、CBN對(duì)AECOPD的治療作用可能與其對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用以及對(duì)花生四烯酸、維生素A等24種內(nèi)源性代謝物水平的調(diào)節(jié)作用相關(guān)�；ㄉ南┧岽x、谷氨酰胺代謝和D-谷氨酸代謝、亞油酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、視黃醇代謝以及三羧酸循環(huán)可能是其發(fā)揮抗AECOPD作用的代謝途徑。創(chuàng)新點(diǎn):1、本研究觀察了中藥獨(dú)活中香豆素類(lèi)天然產(chǎn)物CBN的急性毒性反應(yīng),為評(píng)價(jià)該天然活性成分的毒副作用提供了理論數(shù)據(jù)。2、本研究利用中藥成分多靶點(diǎn)的特性,對(duì)CBN的體內(nèi)、外抗AECOPD作用進(jìn)行了篩選。明確了CBN能對(duì)NTHi誘導(dǎo)AECOPD小鼠氣道炎癥起抑制作用。3、探討了CBN的抗AECOPD氣道炎癥作用機(jī)制。揭示了NOD1/NF-κB通路以及花生四烯酸代謝、谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、亞油酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、視黃醇代謝以及三羧酸循環(huán)可能是CBN發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵信號(hào)通路和代謝途徑。綜上,本論文開(kāi)展的天然成分CBN對(duì)NTHi誘導(dǎo)AECOPD小鼠氣道炎癥的抑制作用與機(jī)制研究,豐富了CBN的藥理毒理研究,可為從傳統(tǒng)中草藥及其天然產(chǎn)物中尋找開(kāi)發(fā)新型安全有效、機(jī)制明確的可替代ICS的抗AECOPD炎癥藥物提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),也其他炎性疾病的治療和作用機(jī)制研究提供思路和啟示。
【圖文】：

氫呋喃香豆素類(lèi)成分[153]。1961 年，首次從氫歐山芹醇，對(duì) CBN 的研究起步較晚，有N 主要存在獨(dú)活中。獨(dú)活(Angelicae Pubesce 一 部 ， 為 傘 形 科 植 物 重 齒 毛 當(dāng) 歸 Shan et Yuan 的干燥根，春初苗剛發(fā)芽或秋末烘至半干，堆置 2～3 天，發(fā)軟后再烘至全效。臨床多用于風(fēng)寒濕痹，，腰膝疼痛，少陰效成分之一即為二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯。-水(1.5∶2.5∶2∶1)為 HSCCC 溶劑系統(tǒng)，在色譜(HSCCC)法分離制備高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 Cg 裂葉獨(dú)活浸膏中，得到 6.4 mg CBN，質(zhì)量裂葉獨(dú)活中 CBN 等香豆素類(lèi)成分的快速分離

圖 2.1 CBN 對(duì) THP-1 細(xì)胞存活率的影響Fig.2.1 Effect of CBN on the viability of THP -1.001,LPS vs Ctrl; * p< 0.05vs LPS group; ** p< 0.01vs LPS groupresentative of three independent experiments with similar results. DatD.N 對(duì) LPS 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞模型中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影確 CBN 是否能夠抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎測(cè)正常組、LPS 組、低劑量組、中劑量組及高劑量組細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、MCP-1 的表達(dá)量。結(jié)果如圖 2.2 所h 后，LPS 模型組中 TNF-α、IL-1β、及 MCP-1 的表達(dá)水高(p<0.001)。CBN 低、中、高劑量組炎性細(xì)胞因子表達(dá)性降低，其中低劑量組降低幅度較小(p<0.01, p<0.05)，中
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2705778