【摘要】：選題依據(jù):肝癌為臨床上常見的惡性疾病,其具有前期不易診斷,晚期致死率高等特點(diǎn),已威脅到患者的生存質(zhì)量及生命;目前針對(duì)肝癌的化療方案存在嚴(yán)重的副作用,因此需要尋求肝癌治療新策略。近年來中藥治療肝癌方面進(jìn)展迅速,其在改善患者病發(fā)癥狀、減輕痛苦、延長生存期方面發(fā)揮著越來越大的作用。針對(duì)中藥治療癌癥方面的文獻(xiàn)調(diào)研,其中柴胡在臨床應(yīng)用及藥理研究領(lǐng)域占據(jù)了一定的席位,其具有抑制肝癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的活性。臨床上運(yùn)用柴胡注射液配合TACE技術(shù)治療肝癌取得較好療效,另有報(bào)道市售的柴胡注射液阻滯肝癌細(xì)胞于S、G2期,從而抑制其增殖;但是未探究柴胡注射液通過何種機(jī)制引起肝癌細(xì)胞周期阻滯以及誘導(dǎo)其凋亡;故此亟待解決柴胡注射液抗肝癌作用機(jī)制,為以后推廣臨床用藥提供參考。另外柴胡注射液主要含有揮發(fā)油類和皂苷類成分等,且皂苷類成分已報(bào)道具有抑制肝癌的作用,小極性成分揮發(fā)油類未見報(bào)道;這提示對(duì)柴胡的研究可從揮發(fā)油類及皂苷類切入。故此研究柴胡不同極性部位,明確其抗肝癌藥效強(qiáng)弱及闡明潛在藥效機(jī)制,為以后合理開發(fā)柴胡在肝癌治療方面提供參考。目的:篩選柴胡不同極性部位體外抗肝癌藥效強(qiáng)弱;研究柴胡不同極性部位及其注射液體外抑制肝癌細(xì)胞增殖及促凋亡作用;基于分子生物學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)探究柴胡不同極性部位及其注射液抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。方法:采用MTT法考察柴胡小極性部位(LPB)、中極性部位(MPB)、大極性部位(HPB)及柴胡注射液(BI)體外抑制肝癌細(xì)胞增殖藥效,以5-FU選做陽性對(duì)照藥;流式細(xì)胞儀檢測BI、LPB、MPB干預(yù)后肝癌細(xì)胞周期阻滯及凋亡狀況;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測BI、LPB、MPB對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響;借助qPCR技術(shù)檢測BI、LPB、MPB干預(yù)后肝癌細(xì)胞中周期相關(guān)基因的變化;借助Western Blot技術(shù)檢測BI、LPB、MPB干預(yù)后肝癌細(xì)胞中凋亡及遷移相關(guān)蛋白的變化;借助LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)探究正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性差異物,以及BI、LPB、MPB干預(yù)后肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性差異物的變化。結(jié)果:1.以IC50值范圍作為參考,柴胡三極性部位(生藥量)間藥效強(qiáng)弱按照:MPB(0.226 mg/mL)㧐LPB(0.437 mg/mL)㧐HPB(大于5.952 mg/mL)。2.流式細(xì)胞儀及qPCR結(jié)果表明:相較于肝癌細(xì)胞組,BI干預(yù)后肝癌細(xì)胞阻滯于S期和G2期,BI組Npas2、CDC25A、CDK2、CyclinA、CDC25B、CDK1、CyclinB1基因表達(dá)量顯著降低(P㩳0.01 or 0.001)。LPB干預(yù)后肝癌細(xì)胞主要阻滯于G1期和G2期,LPB組Npas2、CDK1、CDK2、CyclinE、CyclinB1基因表達(dá)量顯著降低(P㩳0.05);CDC25A,CDC25B呈下降趨勢(shì)(P㧐0.05)。MPB干預(yù)后肝癌細(xì)胞阻滯于G2期,MPB組CDC25B、CDK1、CyclinB1基因顯著降低(P㩳0.05)。3.流式細(xì)胞儀及Western Blot結(jié)果表明:BI、LPB、MPB通過凋亡途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡;BI、LPB、MPB干預(yù)后肝癌細(xì)胞凋亡增加,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P㩳0.001),Bax、Bax/Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P㩳0.01 or 0.001)。4.Western Blot結(jié)果表明:相較于肝癌細(xì)胞組,BI、LPB、MPB組肝癌細(xì)胞遷移力減弱,TIMP-1顯著增加(P㩳0.001),MMP-9/TIMP-1比值顯著降低(P㩳0.01)。5.代謝組學(xué)結(jié)果表明:BI干預(yù)脂質(zhì)代謝途徑、糖酵解途徑、膽汁酸途徑、氨基酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑及核苷酸代謝途徑;LPB干預(yù)糖酵解途徑、氨基酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑和核苷酸代謝途徑;MPB干預(yù)脂質(zhì)代謝途徑、糖酵解途徑、氨基酸代謝途徑、膽汁酸代謝途徑、脂肪酸代謝途徑及核苷酸代謝途徑。結(jié)論:1.BI介導(dǎo)的S期阻滯可能與下調(diào)Npas2-CDC25A-CDK2+CyclinA通路相關(guān);LPB介導(dǎo)的G1期阻滯可能與下調(diào)Npas2-CDC25A-CDK2+CyclinE通路相關(guān);BI、LPB、MPB介導(dǎo)的G2期阻滯可能與下調(diào)CDC25B-CDK1+CyclinB1通路相關(guān)。2.BI、LPB誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制可能與下調(diào)Npas2,CDC25A靶點(diǎn)以及激活線粒體凋亡途徑相關(guān);MPB誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制可能與激活線粒體凋亡途徑相關(guān)。BI、LPB、MPB抑制肝癌細(xì)胞遷移可能與MMP-9/TIMP-1比值下調(diào)相關(guān)。3.BI、LPB、MPB調(diào)控多種內(nèi)源性物質(zhì),調(diào)控眾多代謝通路,從而誘導(dǎo)肝癌凋亡;體現(xiàn)出中藥具有多成分,多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。
【圖文】：

殖抑制結(jié)果果顯示：BI 作用肝癌細(xì)胞 24 h 后，在 50-450 mg加，，抑制效果增強(qiáng)；且在 100-450 mg/mL 范圍，差異；另外對(duì)正常肝細(xì)胞損傷考察，結(jié)果表明相 3.1）。LPB 作用肝癌細(xì)胞 24 h 后，在 0.078-1.0增加抑制效果增強(qiáng)，與對(duì)照組相比具有顯著性結(jié)果表明相同濃度 LPB 對(duì)正常肝細(xì)胞損傷�。ê�，在 0.060-0.484 mg/mL 范圍（生藥量）隨著濃21-0.484 mg/mL 濃度范圍，MPB 組與對(duì)照組相比損傷考察，結(jié)果表明 MPB 相同濃度下，正常肝 3.3）。5.952 mg/mL HPB（生藥量）作用肝癌細(xì)（圖 3.4）；結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[99]，考慮到該部位 IC50MPB 弱，故此未對(duì)該部位再進(jìn)行機(jī)制探究。

胞及肝正常細(xì)胞增殖抑制結(jié)果（n=3）；與肝癌對(duì)照組*P㩳0.05；與肝正常對(duì)照組相比，###P㩳0.001，##P㩳0.0胞及肝正常細(xì)胞增殖抑制結(jié)果（n=3）；與肝癌對(duì)照組*P㩳0.05；與肝正常對(duì)照組相比，###P㩳0.001，##P㩳0.0
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285

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3 劉延;李湘z

本文編號(hào)：2702848