【摘要】：目的:1.探討中藥抗真菌方有無抵御小鼠外陰陰道念珠菌感染的作用。2.觀察中藥抗真菌方對小鼠陰道局部TLR2、TLR4、IL-6、IL-10、IL-12表達(dá)的影響,為今后中醫(yī)藥防治外陰陰道念珠菌病研究提供新的方法與思路。方法:1.運用文獻(xiàn)學(xué)的方法,收集整理古醫(yī)籍治療帶下病的文獻(xiàn),經(jīng)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后建立數(shù)據(jù)庫。利用中醫(yī)傳承軟件平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與分析,對藥物進(jìn)行頻數(shù)、聚類、關(guān)聯(lián)規(guī)則的研究。從中分析古醫(yī)籍治療帶下病的用藥規(guī)律,尋找中藥抗真菌方治療外陰陰道念珠菌病的用藥組方依據(jù)。2.將雌性BALB/c小鼠(8周齡)65只,體重20-25g,隨機(jī)分為3組,分別是中藥組、模型組和空白組,中藥組和模型組每組各30只,空白組5只。模型組小鼠從第1天開始予生理鹽水灌胃,持續(xù)至實驗結(jié)束,第4天皮下注射含有0.1mg戊酸雌二醇的溶液0.1 ml,之后每一周注射一次。在第7天,模型組小鼠陰道內(nèi)接種菌懸液100μl(含有白念珠菌14053孢子量10~8個)。中藥組小鼠從第1天開始予中藥抗真菌方灌胃,持續(xù)至實驗結(jié)束,在第4天皮下注射含有0.1mg戊酸雌二醇的溶液0.1 ml,之后每一周注射一次。在第7天,中藥組小鼠陰道內(nèi)接種菌懸液100μl(含有白念珠菌14053孢子量10~8個)�？瞻捉M小鼠從第1天開始予生理鹽水灌胃,持續(xù)至實驗結(jié)束,第4天皮下注射含有0.1mg戊酸雌二醇的溶液0.1 ml。3.在第8d、9d、10d、12d和14 d、21d(即感染白念珠菌后第1d、2d、3d、5d、7d、14d)中藥組和模型組每組各隨機(jī)選取5只小鼠,麻醉后處死,采集陰道灌洗液及陰道組織。空白組小鼠在第8d將5只小鼠全部麻醉后處死,采集陰道灌洗液及陰道組織。4.用0.1ml含100單位蛋白酶抑制劑(complete,EDTA free)的無菌PBS緩沖液進(jìn)行陰道灌洗。取陰道灌洗液40μl,稀釋10-1000倍后,取稀釋液100μl于酵母膏葡萄糖氯霉素瓊脂培養(yǎng)基上涂布,37℃下培養(yǎng)24h。觀察平板上菌落生長情況,進(jìn)行菌落計數(shù)。5.將陰道灌洗液稀釋后,使用ELISA試劑盒檢測小鼠陰道灌洗液中IL-6、IL-10、IL-12表達(dá)的變化。6.每只小鼠采集的陰道組織分為兩部分,一份采用實時熒光定量PCR檢測小鼠陰道組織中TLR2和TLR4基因表達(dá)水平的變化。另一部分制作成蠟塊標(biāo)本,運用免疫組化染色檢測小鼠陰道組織中TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1.菌落計數(shù):模型組小鼠陰道灌洗液中菌落形成單味(CFU)出現(xiàn)一過性升高,在感染后第3天達(dá)到峰值,后逐漸下降,維持在一個低水平狀態(tài)。中藥組小鼠陰道灌洗液中CFU在感染后前3天未出現(xiàn)明顯增加,其數(shù)值保持在一個穩(wěn)定范圍內(nèi),隨后CFU數(shù)值逐漸下降。中藥組小鼠陰道灌洗液中CFU值明顯低于模型組。在感染后第3天、第5天、第7天、第14天時,兩組小鼠陰道灌洗液中CFU差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。且在中藥組小鼠中,感染后第3d有1例轉(zhuǎn)陰,感染后第7d有2例轉(zhuǎn)陰。空白對照組小鼠陰道灌洗液培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)白念珠菌。2.RT-PCR和免疫組化:TLR2和TLR4 mRNA相對表達(dá)量在模型組與中藥組小鼠陰道組織中均有增加。模型組TLR2 mRNA表達(dá)增加后穩(wěn)定在一個范圍內(nèi),TLR4 mRNA表達(dá)出現(xiàn)一過性升高,在感染后第7天到達(dá)峰值,后開始下降。中藥組TLR2 mRNA表達(dá)增加后也穩(wěn)定在一個范圍內(nèi),但是增長幅度明顯大于模型組,在感染后第2-14天與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。中藥組TLR4 mRNA表達(dá)在感染后第3天達(dá)到峰值,后逐漸下降,變化趨勢與模型組相同,但是TLR4 mRNA的增長幅度大于模型組,兩組數(shù)值在感染后第3天、第5天、第7天的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。通過免疫組化方法比較后發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)與mRNA表達(dá)的變化趨勢相同。模型組與中藥組的TLR2蛋白數(shù)值在感染后第1-7天的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),TLR4蛋白數(shù)值在感染后第1天、第3-14天的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TLR2和TLR4mRNA相對表達(dá)量與免疫組化結(jié)果呈正相關(guān)(P0.05)。3.細(xì)胞因子:模型組與中藥組小鼠陰道灌洗液中IL-6濃度較空白組均出現(xiàn)增長,且隨著時間推移逐漸增大。但是模型組與中藥組小鼠陰道灌洗液的IL-6差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。模型組IL-12濃度從感染后第3天開始明顯增加,于感染后第7天出現(xiàn)下降。中藥組IL-12濃度低于模型組,在感染后第3天出現(xiàn)一過性增加,后開始下降。在感染后第3天、第5天、第7天模型組與中藥組小鼠陰道灌洗液中IL-12差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。模型組與中藥組小鼠陰道灌洗液中IL-10濃度較空白組均降低,下降后維持在穩(wěn)定的較低水平范圍內(nèi),在感染后第1天和第2天兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TLR2 mRNA相對表達(dá)量與陰道微環(huán)境中IL-10濃度呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。結(jié)論:1.中藥抗真菌方有抵御小鼠陰道粘膜感染白念珠菌的作用,可以明顯減少小鼠陰道中白念珠菌的數(shù)量。2.小鼠可以通過TLR2和TLR4調(diào)控陰道粘膜抵御白念珠菌的感染過程。小鼠陰道粘膜感染白念珠菌與陰道局部免疫IL-6、IL-10、IL-12失衡有關(guān)。3.中藥抗真菌方通過TLR2和TLR4的信號通路干預(yù)念珠菌的感染。中藥抗真菌方可能通過影響IL-10和IL-12的表達(dá)發(fā)生作用。4.TLR2信號通路的上調(diào)抑制IL-10的表達(dá)可能在小鼠陰道粘膜感染白念珠菌過程中起到重要作用。
【圖文】：

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)）圖 1.2.1 Th 細(xì)胞的分化及效應(yīng)Fig.1.2.1 differentiation and effective of Th朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells）是位于表皮和胃腸道上皮部位的未成熟DC。道粘膜下層中存在朗格漢斯細(xì)胞，可以提呈抗原，存在主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ[57]。

S, 2004, Nat圖 1.3.1 TLRs 結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1.3.1 Structure of TLRs 型跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)由 16-28 個前后相連的片段組成，，每個片段包括 20
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2701068