【摘要】：過敏反應(yīng)或超敏反應(yīng)是機(jī)體接觸抗原物質(zhì)或半抗原物質(zhì)后引起的特殊免疫應(yīng)答,屬于變態(tài)反應(yīng)中反應(yīng)性過高的類型(I型變態(tài)反應(yīng)),臨床表現(xiàn)為腫、癢、疹、喘、流液等癥狀。呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及皮膚由于廣泛接觸外來抗原,成為過敏性疾病的好發(fā)部位,包括支氣管哮喘、消化系統(tǒng)變態(tài)反應(yīng)、蕁麻疹等[1]。玉屏風(fēng)散(yu-ping-feng-san,YPFS)是益氣固表的經(jīng)典名方,由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成,在過敏性疾病中廣泛應(yīng)用[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MC903誘導(dǎo)的小鼠皮炎模型中,NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著升高,同時(shí)引起上皮細(xì)胞分泌的關(guān)鍵促過敏因子IL-33的升高。玉屏風(fēng)散可顯著抑制MC903誘導(dǎo)的小鼠皮炎模型中NLRP3、IL-33的表達(dá),因此提示NLRP3與IL-33之間可能具有相關(guān)性。本論文進(jìn)一步對玉屏風(fēng)散效應(yīng)成分影響NLRP3與IL-33的作用進(jìn)行研究,并探索過敏性疾病中NLRP3與IL-33的作用關(guān)系及機(jī)制。本研究主要從以下四個(gè)方面進(jìn)行探討。1.玉屏風(fēng)散效應(yīng)成分體內(nèi)外對NLRP3、IL-33的影響在MC903誘導(dǎo)的小鼠特異性皮炎模型上,分別給予玉屏風(fēng)散效應(yīng)成分毛蕊異黃酮、芒柄花素、升麻素,考察其對小鼠特異性皮炎模型的影響,包括耳腫脹度、炎性浸潤、促炎細(xì)胞因子水平以及NLRP3、IL-33表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),芒柄花素可有效抑制MC903引起的耳腫脹、炎性浸潤,同時(shí)降低IgE、IL-33分泌水平,并可明顯減少NLRP3、IL-33的表達(dá)。體外建立NLRP3高表達(dá)模型,HaCaT細(xì)胞上分別給予過敏原MC903、FITC以及促炎刺激因子LPS和氧化應(yīng)激產(chǎn)物ATP刺激,檢測NLRP3、IL-33的蛋白表達(dá)水平;在體外建立的NLRP3高表達(dá)模型中,分別應(yīng)用玉屏風(fēng)散提取物及其效應(yīng)成分毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪-甲苷、升麻素,檢測其對NLRP3、IL-33的作用。結(jié)果表明1)LPS聯(lián)合ATP刺激HaCaT細(xì)胞,可顯著升高NLRP3、IL-33的表達(dá);2)芒柄花素抑制NLRP3、IL-33表達(dá)作用最為明顯。上述體內(nèi)外研究結(jié)果可見,玉屏風(fēng)散效應(yīng)成分在影響IL-33的同時(shí),也可影響NLRP3的表達(dá),提示NLRP3與IL-33可能存在一定的關(guān)聯(lián)。2.NLRP3調(diào)控IL-33的關(guān)系確認(rèn)在體外建立的NLRP3高表達(dá)模型中,分別轉(zhuǎn)染NLRP3 siRNA和IL-33 siRNA,以及NLRP3過表達(dá)質(zhì)粒,檢測NLRP3、IL-33的蛋白表達(dá)水平,確證NLRP3與IL-33作用上下游關(guān)系;并在人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)中對NLRP3、IL-33作用關(guān)系進(jìn)行探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上皮細(xì)胞中,過表達(dá)NLRP3可顯著升高IL-33表達(dá),沉默NLRP3可顯著降低IL-33表達(dá),而沉默IL-33對NLRP3表達(dá)未見明顯影響�？梢奛LRP3能促進(jìn)IL-33的表達(dá)。3.IRF4參與NLRP3調(diào)控IL-33作用在HaCaT細(xì)胞中檢測IL-33相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(p-NF-κB、p-STAT3、AP-1、IRF3、IRF4、IRF7)蛋白表達(dá)水平或基因表達(dá)水平;在HaCaT/16HBE細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染IRF4 siRNA和IRF4過表達(dá)質(zhì)粒,檢測IRF4對NLRP3、IL-33蛋白表達(dá)水平的影響;在HaCaT細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),檢測IRF4與NLRP3的蛋白相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1)IRF4在NLRP3高表達(dá)模型中蛋白和基因水平均顯著性升高;2)過表達(dá)IRF4可顯著升高NLRP3、IL-33表達(dá),沉默IRF4可明顯降低NLRP3、IL-33表達(dá);3)IRF4與NLRP3存在蛋白互作�？梢奍RF4參與NLRP3調(diào)控IL-33作用,且可能與二者蛋白的結(jié)合有關(guān)。4.NLRP3調(diào)控IL-33作用機(jī)制探索分別提取HaCaT細(xì)胞的胞漿蛋白和胞核蛋白,檢測NLRP3蛋白在胞內(nèi)的表達(dá)分布情況;染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測NLRP3蛋白與IL-33DNA結(jié)合情況;酵母單雜交實(shí)驗(yàn)檢測IRF4/NLRP3蛋白與IL-33啟動(dòng)子結(jié)合情況;在MC903誘導(dǎo)的小鼠特異性皮炎模型上,分別給予ASC寡聚抑制劑—MCC950和Caspase-1活性抑制劑—VX-765,考察其對小鼠特異性皮炎模型的影響,包括耳腫脹度、炎性浸潤、促炎細(xì)胞因子水平以及NLRP3、IL-33表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1)NLRP3主要表達(dá)于上皮細(xì)胞的胞核內(nèi);2)NLRP3蛋白與IL-33啟動(dòng)子DNA序列存在結(jié)合;3)NLRP3炎癥小體復(fù)合物中的ASC寡聚以及Caspase-1活化對NLRP3調(diào)控IL-33作用未見明顯影響。這提示NLRP3調(diào)控IL-33主要與其轉(zhuǎn)錄功能有關(guān),而不依賴經(jīng)典炎癥小體途徑。研究結(jié)論:1.玉屏風(fēng)散效應(yīng)成分芒柄花素可顯著抑制因MC903引起的小鼠耳腫脹、炎性浸潤以及耳組織中NLRP3、IL-33表達(dá)水平,體外芒柄花素也可有效抑制NLRP3、IL-33的表達(dá);2.NLRP3不依賴經(jīng)典炎癥小體途徑調(diào)控IL-33表達(dá),而是通過與IL-33啟動(dòng)子DNA序列結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用;NLRP3調(diào)控IL-33作用受IRF4的影響。
【圖文】：

ＰＢＳ洗滌細(xì)胞（５邋ｍｉｎ／次，３次），０．２％邋Ｔｒｉｔｏｎ－１００破膜，ｏｎ－１００，邋ＰＢＳ邋洗滌細(xì)胞（５邋ｍｉｎ／次，３邋次），１．５％邋ＢＳＡ，封閉，室，邋ＰＢＳ洗滌細(xì)胞（５邋ｍｉｎ／次，３次），結(jié)合相應(yīng)一抗，４邋°Ｃ，過夜；，，ＰＢＳ洗滌細(xì)胞（１０邋ｍｉｎ／次，３次），結(jié)合相應(yīng)二抗，避光，室，ＰＢＳ洗滌細(xì)胞（１０邋ｍｉｎ／次，３次），０．２％ＤＡＰＩ染核，避光，室溫，１ＰＩ，ＰＢＳ洗滌細(xì)胞（１０邋ｍｉｎ／次，３次），抗熒光淬滅劑鋪于玻底，Ｐ刺激ＨａＣａＴ細(xì)胞對ＮＬＲＰ３、ＩＬ－３３胞內(nèi)分布的影響。逡逑／ｍＬ）聯(lián)合ＡＴＰ邋（５邋ｍＭ）刺激ＨａＣａＴ細(xì)胞，提取胞漿蛋白和胞，ＮＬＲＰ３在細(xì)胞內(nèi)分布明顯增多，且主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，ＩＬ－表達(dá)。免疫熒光結(jié)果同樣顯示：ＮＬＲＰ３主要分布在ＨａＣａＴ細(xì)明顯增多。逡逑ｕｃｅｕｓｔｏｌａｓｍ逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2701135