【摘要】：目的:利用酶高效性和專一性特點,探討甲基化酶與乙酰化酶系列,分析其相關(guān)表觀遺傳學(xué)特性。從全新的角度探索和驗證中藥歸經(jīng)理論的實質(zhì),初步探索中藥歸經(jīng)評價體系客觀化標(biāo)準(zhǔn)。方法:1、各組含藥血清的采集與制備隨機取SPF級雄性6-8w的SD大鼠9只,將制備好的歸肝經(jīng)的蒺藜、歸腎經(jīng)的蛇床子、歸肝腎經(jīng)的川續(xù)斷三味中藥的水煎劑,連續(xù)7天灌胃給大鼠,每天2次,每次灌胃后觀察大鼠活動狀態(tài)有無異常。灌胃第7日,即末次灌胃后在一定時間內(nèi)(末次灌胃前12小時禁食不禁水)股動脈取血。再將裝有股動脈血的真空采血管置于4℃冰箱2h,3000rpm/min離心15min,吸出上清液移入離心管,再放入56℃水浴鍋30min以滅活補體,防止細(xì)胞毒,用0.22μm針式濾器過濾,制備好后密封放入零下80℃冰箱備用。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定本實驗選用全骨髓培養(yǎng)法,取SD大鼠,頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡3-5分鐘。用碘伏棉球消毒皮膚,無菌條件下取出雙側(cè)完整的股骨和肱骨,置于培養(yǎng)皿中小心剔除粘連于骨上的肌肉組織,剪斷骨端,用抽取適量培養(yǎng)基的注射器插入骨內(nèi)反復(fù)沖洗骨髓腔,直至骨發(fā)白,沖洗液直接收集在離心管中,離心5min(1500rpm/min),棄上清,加入新鮮的完全培養(yǎng)基(含10%FBS,1/100ml雙抗溶液),接種于培養(yǎng)皿中,置于37℃、5%CO_2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24h首次半量換液,3d全量換液,以后每2-3d換液1次,待細(xì)胞生長至約80%融合時,用0.25%胰蛋白酶溶液消化,按1:1比例常規(guī)傳代。通過不斷的更新培養(yǎng)基來進(jìn)行純化,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、繪制生長曲線,采用流式細(xì)胞儀對CD90、CD34、CD45表面抗原進(jìn)行鑒定。3、各組歸經(jīng)含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用第3代BMSCs做細(xì)胞懸液,用血小球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1×10~6/ml,每孔500μl接種于24孔板。將細(xì)胞分為四大組:空白組、蒺藜組、蛇床子組和川續(xù)斷組。藥物組分為24h和72h兩大組,每個藥物組細(xì)胞再分為20%和10%兩個高、低血清濃度組,空白組用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。各組細(xì)胞置于37℃、5%CO_2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和72h。4、不同歸經(jīng)藥物對BMSCs的表觀修飾相關(guān)基因表達(dá)影響采用q-RT-PCR法分別檢測Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1對用藥BMSCs作用24h和72h的mRNA表達(dá)量的影響。5、不同歸經(jīng)藥物對臟器組織的表觀修飾相關(guān)基因表達(dá)影響采用q-RT-PCR法分別檢測Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1對肝臟、腎臟和脾臟的mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果:1、灌胃期間,三組大鼠精神充沛,活動靈便,飲食正常,皮毛整潔,體重增長良好,大便正常,各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。2、剛分離的原代細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,大小不一,多數(shù)呈圓形或橢圓形,24h后可見部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁,呈紡錘形、多角形等多種形態(tài),3d后細(xì)胞形成散在集落,細(xì)胞突起變長,長短不一,粗細(xì)不均。傳代后的細(xì)胞生長速度明顯加快,貼壁所用時間短,至2代后,細(xì)胞呈梭形,似成纖維樣細(xì)胞,形態(tài)均一,呈漩渦狀有序排列,可見少許懸浮細(xì)胞,換液后懸浮細(xì)胞消失。通過流式細(xì)胞儀鑒定第三代培養(yǎng)細(xì)胞,結(jié)果顯示其細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90呈陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為94%;CD34和CD45均呈陰性表達(dá),表達(dá)率分別為14.2%和1.1%。其結(jié)果說明了本實驗室所用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)、純化的BMSCs達(dá)到了要求。3、接種于24孔板的BMSCs,通過采用上述細(xì)胞用藥的方法,觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)用藥24h后細(xì)胞形態(tài)依舊呈梭型,似成纖維細(xì)胞樣,見少許懸浮細(xì)胞。用藥72h后,細(xì)胞培養(yǎng)基稍許渾濁,見較多懸浮細(xì)胞。4、藥物作用BMSCs 24h后,川續(xù)斷高濃度組的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a和Hdac1 mRNA相對表達(dá)量比其他藥物組明顯較高(P0.05),且Dnmt3a、Camkmt和Hdac1表達(dá)量大于1,說明其在藥物作用BMSCs 24h中具有表達(dá)上調(diào)的趨勢。藥物作用BMSCs 72h后,蒺藜高濃度組的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a和Hdac1 mRNA相對表達(dá)量比其他藥物組較高(P0.05),且Camkmt和Kat2a表達(dá)量大于1,說明其在藥物作用BMSCs 72h中具有表達(dá)上調(diào)的趨勢。5、在肝組織中,蒺藜組的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a和Hdac1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于其他藥物組(P0.05),且Kdm1a和Kat2a表達(dá)量大于1,說明其在肝組織中具有表達(dá)上調(diào)的趨勢。在腎組織中,蛇床子組的Camkmt mRNA相對表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他藥物組,(P0.05),且表達(dá)量大于1,說明蛇床子組的Camkmt在腎組織中具有表達(dá)上調(diào)的趨勢。而Dnmt3a、Kdm1a、Hdac1 mRNA相對表達(dá)量在各藥物組中都相對較低,不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在脾組織中,川續(xù)斷組的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于其他藥物組(P0.05),且表達(dá)量均大于1,說明其在脾組織中具有表達(dá)上調(diào)的趨勢。結(jié)論:1、本實驗的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng),采用了簡單易操作的也是最為常用的全骨髓培養(yǎng)法,通過不斷的更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行純化,最后采用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物,其結(jié)果與諸多文獻(xiàn)報道結(jié)果一致,說明此方法能夠分離培養(yǎng)出較為純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2、從動物臟器上來看,歸肝經(jīng)的蒺藜對灌胃大鼠的肝臟中5種表觀遺傳酶mRNA的相對表達(dá)量均明顯升高。說明歸肝經(jīng)藥物集中影響,證明了中藥歸經(jīng)理論的合理性。而歸肝腎經(jīng)的川續(xù)斷在灌胃大鼠的脾臟中多種表觀遺傳酶具有表達(dá)上調(diào)的趨勢,可能說明中藥歸經(jīng)理論來源于古人的臨床實踐,通過觀察藥物的臨床反應(yīng)來判斷藥物療效和歸經(jīng),并不是單純的中醫(yī)臟腑與解剖臟器上的一一對應(yīng)。3、從酶表觀特性的結(jié)果來看,其在不同歸經(jīng)藥物的作用下,發(fā)生了靈敏的表觀遺傳表達(dá)改變,說明其容易受到不同歸經(jīng)藥物的影響,或許可作為中藥歸經(jīng)評價體系客觀化標(biāo)準(zhǔn)的候選基因。
【圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，呈紡錘形、多角形等多種形態(tài)，3d 后細(xì)胞形成散在集落，細(xì)胞突起變長，突起長短不一，粗細(xì)不均。傳代后的細(xì)胞生長速度明顯加快，貼壁所用時間短，至 2 代后，細(xì)胞呈梭形，似成纖維樣細(xì)胞，形態(tài)均一，呈漩渦狀有序排列，，可見少許懸浮細(xì)胞，換液后懸浮細(xì)胞消失。見圖 2-1。

圖 2-2：抗 CD90 陽性，抗 CD45 和抗 CD34 陰性BMSCs 增殖結(jié)果第 3 代 BMSCs，使用 CCK-8 試劑盒連續(xù)在同一時間檢測 7d，按照 OD 值結(jié)長曲線圖。見圖:2-3。第 1 天比較，第 2-7 天均升高，其中檢測第 2-4 天 BMSCs 增殖結(jié)果最為明液時間為 3 天，藥物血清作用 BMSCs 的給藥時間取 24h 和 72h 作為對照。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2701013