【摘要】：第一部分自噬對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的調(diào)節(jié)及機(jī)制目的:1、研究缺氧對(duì)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMECs)間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)及自噬的影響;2、研究自噬對(duì)缺氧誘導(dǎo)的HCMECs EndMT的影響及具體機(jī)制。方法:1、探究缺氧狀態(tài)下對(duì)HCMECs EndMT的影響。實(shí)驗(yàn)主要分為2組(1)control組:常氧(21%O2、5%CO2、74%N2,37℃)條件下培養(yǎng)HCMECs3天;(2)hypoxia組:缺氧(1%O2、5%CO2、74%N2,37℃)條件下培養(yǎng)HCMECs3天,分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):⑴光學(xué)顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;⑵RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞中CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1及Snail mRNA相對(duì)表達(dá)水平;⑶Western blot測(cè)定兩組細(xì)胞CD31、E-Cadherin、ɑSMA、FSP-1、Snail蛋白表達(dá)水平;⑷雙重免疫熒光染色觀察CD31、αSMA及FSP-1表達(dá)變化及并對(duì)CD31+αSMA+/FSP+雙陽(yáng)性細(xì)胞(說(shuō)明正在發(fā)生EndMT的細(xì)胞)和CD31-SMA+/FSP+細(xì)胞(說(shuō)明已經(jīng)發(fā)生EndMT的細(xì)胞)計(jì)數(shù)分析。2、探究缺氧狀態(tài)下HCMECs自噬水平的變化。⑴HCMECs缺氧3天內(nèi)LC3蛋白的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化,通過(guò)Western blot法測(cè)定HCMECs缺氧0,2,4,6,12,24,48,72 h處LC3表達(dá)變化;⑵將細(xì)胞分為以下4組:(1)control組:常氧條件下培養(yǎng)HCMECs;(2)氯喹(Chloroquine,CQ)(20μm)組:常氧條件下加入氯喹處理HCMECs 8小時(shí);(3)hypoxia組:缺氧條件下培養(yǎng)HCMECs 6小時(shí);(4)hypoxia+CQ(20μm)組:常氧條件用氯喹處理HCMECs 2小時(shí),缺氧培養(yǎng)6小時(shí);Western blot法分別測(cè)定各組LC3表達(dá)變化;⑶轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的HCMECs在缺氧3天內(nèi)GFP-LC3表達(dá)動(dòng)態(tài)變化,通過(guò)激光共聚焦觀察HCMECs缺氧0,2,6,12,24,36,48,72 h處GFP-LC3表達(dá)變化。3、探究缺氧狀態(tài)下自噬對(duì)HCMECs EndMT的影響及相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)主要分為以下5組(1)control組:常氧條件下培養(yǎng)HCMECs 3天;(2)hypoxia組:缺氧條件下培養(yǎng)HCMECs 3天;(3)hypoxia+雷帕霉素(rapmycin,rap)(100nm)組:雷帕霉素預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí),后將HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天;(4)hypoxia+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(5mm)組:3-MA預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí),后將HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天;(5)hypoxia+CQ(20μm)組:氯喹預(yù)處理細(xì)胞2小時(shí),后將HCMECs置于缺氧條件下培養(yǎng)3天。分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):⑴雙重免疫熒光染色觀察CD31及αSMA表達(dá)變化并對(duì)CD31+αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD31-SMA+細(xì)胞計(jì)數(shù)分析;激光共聚焦顯微鏡下觀察Snail及LC3在HCMECs的共定位;⑵RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞中CD31、E-Cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、TGFβ2、Smad2及Smad3的mRNA表達(dá)水平并比較分析;⑶Western blot測(cè)定各組細(xì)胞中CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、LC3、beclin1、TGFβ2、Smad2、p-Smad2、Smad3及p-Smad3蛋白表達(dá)并比較分析。結(jié)果1、缺氧誘導(dǎo)HCMECs發(fā)生EndMT:⑴光學(xué)顯微鏡可見(jiàn):control組HCMECs保持典型的鋪路石或鵝卵石樣內(nèi)皮細(xì)胞樣外觀;而缺氧狀態(tài)下細(xì)胞逐漸呈紡錘型樣變化,且隨時(shí)間變化愈明顯。⑵RT-PCR結(jié)果顯示:與control組相比,hypoxia組HCMECs的CD31、E-cadherin mRNA表達(dá)下降,而αSMA、FSP-1及Snail mRNA表達(dá)升高(P0.05)。⑶Western blot結(jié)果顯示:與control組相比,hypoxia組HCMECs的CD31、E-cadherin蛋白表達(dá)下降,而αSMA、FSP-1及Snail蛋白表達(dá)升高(P0.05)。⑷雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示:與control組相比,hypoxia組HCMECs中CD31表達(dá)逐漸減弱,αSMA/FSP-1強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),CD31+αSMA+/FSP+雙陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加甚至出現(xiàn)CD31-SMA+/FSP+細(xì)胞(P0.05)。2、缺氧誘導(dǎo)HCMECs發(fā)生EndMT:⑴Western blot結(jié)果顯示:當(dāng)HCMECs缺氧培養(yǎng)3天時(shí),在4小時(shí)處LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增加,12至24小時(shí)達(dá)高峰,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)略有下降(P0.05)。⑵western blot結(jié)果示:相比于control組,hypoxia組和CQ組LC3 II增加,氯喹使缺氧狀態(tài)下LC3 II增加更顯著(P0.05)。⑶GFP-LC3斑點(diǎn)聚集試驗(yàn)結(jié)果示:當(dāng)HCMECs缺氧培養(yǎng)3天時(shí),GFP-LC3熒光表達(dá)在約4-6小時(shí)開(kāi)始開(kāi)始由彌撒分布向聚集顆粒狀轉(zhuǎn)變,12小時(shí)至24小時(shí)這種聚集狀態(tài)升至高峰,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)這種聚集改變下降,但仍高于對(duì)照組水平(P0.05)。3、缺氧狀態(tài)下自噬對(duì)HCMECs EndMT的影響及相關(guān)機(jī)制:⑴雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示:相比hypoxia組,hypoxia+rap組CD31表達(dá)強(qiáng)度增加,αSMA表達(dá)強(qiáng)度下降,而hypoxia+3-MA/CQ組CD31表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步下調(diào),αSMA表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步增加。相比control組,hypoxia組Snail和LC3表達(dá)強(qiáng)度增加;相比hypoxia組,hypoxia+rap組LC3表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步增加和Snail表達(dá)強(qiáng)度下降,hypoxia+3-MA組LC3表達(dá)強(qiáng)度下降和Snail表達(dá)強(qiáng)度增加,hypoxia+CQ組LC3和Snail表達(dá)強(qiáng)度都進(jìn)一步增加(P0.05)。⑵RT-PCR結(jié)果顯示:相比hypoxia組,hypoxia+rap組TGFβ2、smad2、smad3及Snail mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變,CD31、E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào),αSMA、FSP-1表達(dá)下調(diào)(P0.05),hypoxia+3-MA/CQ組TGFβ2、smad2、smad3及Snail mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯改變,CD31、E-cadherin mRNA表達(dá)下降,αSMA、FSP-1表達(dá)上調(diào)(P0.05)。⑶Western blot結(jié)果顯示:雷帕霉素增加了缺氧狀態(tài)下自噬相關(guān)蛋白LC3,beclin1的表達(dá),抑制了缺氧誘導(dǎo)的CD31、E-cadherin的下調(diào)及αSMA、FSP-1、Snail的上調(diào),3-MA和氯喹抑制了缺氧狀態(tài)下自噬的發(fā)生,進(jìn)一步促進(jìn)了缺氧引起的CD31、E-cadherin的下調(diào)及αSMA、FSP-1、Snail的上調(diào)(P0.05)。缺氧狀態(tài)下,TGFβ2、p-smad2和p-smad3表達(dá)上調(diào)(P0.05);相比hypoxia組,缺氧聯(lián)合雷怕霉素、3-MA或氯喹后TGFβ2、p-smad2和p-smad3表達(dá)均未見(jiàn)明顯改變。結(jié)論1、缺氧能同時(shí)誘導(dǎo)HCMECs發(fā)生EndMT及自噬;2、缺氧可通過(guò)激活TGF-β信號(hào)通路引起EndMT;3、缺氧誘導(dǎo)的自噬對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)性作用,可通過(guò)促進(jìn)Snail降解抑制EndMT。第二部分自噬對(duì)心肌梗死后EndMT及心肌纖維化的調(diào)節(jié)及機(jī)制目的:探討在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后,通過(guò)干預(yù)自噬水平抑制EndMT進(jìn)而減少心肌纖維化的的可行性。方法:取10周齡SD大鼠隨機(jī)分為以下4組(1)Sham組:不對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理,余處理同AMI組;(2)AMI組:對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理;(3)AMI+rap(2 mg/kg/day):對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理,隨即腹腔注射雷帕霉素,每天一次,持續(xù)14天;(4)AMI+3-MA(15 mg/kg/day):對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎處理,隨即腹腔注射3-MA,每天一次,持續(xù)14天;分別對(duì)各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):⑴心肌梗死14天后心臟彩超觀察各組大鼠LVEF、LVFS、LVIDd及LVIDs變化并比較分析;⑵心肌梗死14天后Masson’s trichrome染色檢測(cè)各組大鼠心肌膠原纖維化面積并比較分析;⑶心肌梗死7天后Western blot測(cè)定各組大鼠左室心肌梗死區(qū)域CD31、αSMA、COL1、LC3、beclin1的表達(dá)水平及比較分析;⑷心肌梗死7天后對(duì)左室心肌梗死區(qū)域雙重免疫熒光染色觀察CD31+αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞LC3的表達(dá)水平。結(jié)果:⑴大鼠心臟彩超結(jié)果顯示:SD大鼠心肌梗死14天后,LVIDd、LVIDs擴(kuò)大,LVEF、LVFS減低;雷帕霉素抑制心肌梗死后LVIDd、LVIDs的擴(kuò)大及LVEF、LVFS減低(P0.05);3-MA并不能改善心肌梗死后心功能。⑵Masson’s trichrome染色結(jié)果顯示:SD大鼠心肌梗死14天后,左室梗死區(qū)域纖維化顯著;雷帕霉素顯著減少心肌梗死后心肌纖維化面積;3-MA顯著增加心肌梗死后心肌纖維化面積(P0.05)。⑶左室心肌梗死區(qū)域western blot結(jié)果顯示:LC3-II在心肌梗死后1天內(nèi)顯著上升,而后表達(dá)逐漸減低;心肌梗死7天后,CD31表達(dá)下降,αSMA、COL1表達(dá)增加,LC3、beclin1未見(jiàn)明顯改變;雷帕霉素增加了LC3及beclin1的表達(dá),顯著抑制了心肌梗死后的CD31表達(dá)下降和αSMA、COL1表達(dá)增加;3-MA降低了LC3及beclin1的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)了心肌梗死后的CD31表達(dá)下降和αSMA、COL1表達(dá)增加(P0.05)。⑷左室心肌梗死區(qū)域雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示:CD31+/αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞在心肌梗死后第7天明顯上升,雷帕霉素可明顯減少心肌梗死后CD31+/αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞,3-MA可增加心肌梗死后CD31+/αSMA+雙陽(yáng)性細(xì)胞(P0.05);心肌梗死后CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞LC3表達(dá)變化改變不明顯,雷帕霉素可增加心肌梗死后CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞LC3表達(dá)水平,3-MA可減低心肌梗死后CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞LC3表達(dá)水平(P0.05)。結(jié)論:EndMT促進(jìn)了心肌梗死后的心肌纖維化,而提高心肌梗死后的自噬水平可抑制EndMT,減輕心肌纖維化,改善心功能。
【圖文】：

普通光學(xué)顯微鏡下HCMECs

Control hypoxia圖 2-1 普通光學(xué)顯微鏡下缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（100×）T-PCR比 Control 組，HCMECs 缺氧 3 天后內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物 CD31、E-
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉艷華;李賓公;王裕勤;王得龍;鄒晉;柯旋;郝艷琴;;敲低Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)抑制低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2016年12期

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本文編號(hào)：2701011