【摘要】：第一部分溫陽活血法對高磷誘導(dǎo)兔主動脈平滑肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的調(diào)控目的:探討溫陽活血法對高磷誘導(dǎo)兔主動脈平滑肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的影響材料和方法:將兔主動脈平滑肌細(xì)胞隨機分為6組,分別為:β-GP(-)組,β-GP(+)組,空白血清組,維拉帕米組,蠲脈I號方溫陽拆方組(以下簡稱拆方組)和蠲脈I號方全方組(以下簡稱全方組)。10mmol/Lβ-甘油磷酸培養(yǎng)基中添加10%FBS培養(yǎng)兔主動脈平滑肌細(xì)胞14天建立鈣化模型,β-GP(-)組使用10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng),造模14天完成后,茜素紅S(1%,PH4.2)染色判斷VSMCs鈣化情況。選取8只健康雄性新西蘭大白兔制備空白血清組,維拉帕米組,拆方組和全方組含藥血清。MTT法檢測各組含藥血清對兔主動脈平滑肌細(xì)胞的毒性作用,計算半數(shù)抑制率(IC50)。兔主動脈平滑肌細(xì)胞接種至12孔板,分別使用對應(yīng)的培養(yǎng)基干預(yù)6天,加入flou-4 AM探針,熒光顯微鏡下觀察鈣化細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強度。采用比色法檢測各組兔主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。ELISA測定各組血清干預(yù)后兔主動脈平滑肌細(xì)胞CAN活性。結(jié)果:MTT結(jié)果顯示β磷酸甘油對兔主動脈平滑肌細(xì)胞活力具有抑制作用(P0.05),抑制率為19.65%;兔空白血清對CCC-SMCs活力具有促進作用(P0.05),并隨著血清濃度的增高,細(xì)胞活力增強,5%,10%,15%及20%的空白血清對應(yīng)細(xì)胞活性分別為β-GP(-)組的134.2%,158.7%,161.5%,169.3%。與空白血清組比較,維拉帕米組維拉帕米對兔主動脈平滑肌細(xì)胞活性無明顯抑制作用(P=0.675);全方組及拆方組隨著含藥血清濃度增加,對CCC-SMCs的抑制率增加。全方組IC50為19.67%,拆方組IC50為25.98%。茜素紅S染色液(1%,PH4.2)結(jié)果顯示β-甘油磷酸誘導(dǎo)的CCC-SMCs鈣化組出現(xiàn)較多橘紅色鈣結(jié)節(jié)、細(xì)胞質(zhì)紅染;對照組亦可見少量鈣化結(jié)節(jié)形成,細(xì)胞質(zhì)紅染。由此表明:CCC-SMC可在正常連續(xù)培養(yǎng)14天后自發(fā)形成鈣化結(jié)節(jié),經(jīng)過β甘油磷酸誘導(dǎo)的CCC-SMCs 14天促進鈣化的形成。Fluo4AM熒光探針檢測CCC-SMCs內(nèi)鈣離子顯示,與β-GP(-)組比較,β-GP(+)組平均熒光強度明顯增高,P0.05,表明β-GP干預(yù)后CCC-SMCs內(nèi)鈣離子濃度明顯增高;空白血清組較β-GP(-)組熒光強度明顯增強,P0.05,表明兔血清可促進細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流。以空白血清組作為陰性對照組,全方組、拆方組及維拉帕米組細(xì)胞熒光強度均明顯較弱,P0.05,表明全方組、拆方組及維拉帕米組含藥血清均可抑制CCCSMCs鈣離子內(nèi)流。通過比色法檢測各組含藥血清干預(yù)6d后,CCCSMCs內(nèi)鈣離子濃度,結(jié)果顯示,與β-GP(-)組比較,β-GP(+)組平均鈣離子濃度明顯增高,P0.05。與空白血清組作為陰性對照組,全方組、拆方組及維拉帕米組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均較空白血清組明顯降低,P0.05,表明全方組、拆方組及維拉帕米組含藥血清均可抑制CCCSMCs鈣離子內(nèi)流。各組含藥血清干預(yù)6d后,ELISA測定CCC-SMCs內(nèi)CAN活性。建立標(biāo)準(zhǔn)品曲線,R值為相關(guān)系數(shù),R2=0.9859,表明曲線線性關(guān)系較好,具有可行性。以β-GP(-)組作為陰性對照,β磷酸甘油組干預(yù)后CCC-SMCs內(nèi)CAN活力明顯上升,P0.05;以空白血清組作為陰性對照,顯示維拉帕米組、全方組、拆方組干預(yù)后對CCCSMCs內(nèi)CAN活性具有明顯抑制作用,P0.05。小結(jié)①全方組、拆方組及維拉帕米組含藥血清均可明顯抑制CCC-SMCs鈣離子內(nèi)流。②全方組、拆方組及維拉帕米組含藥血清均可抑制CCC-SMCs內(nèi)CAN活性。③溫陽拆方組較全方組及維拉帕米組對CCC-SMCs鈣離子內(nèi)流的抑制作用明顯。④溫陽活血法可能通過抑制CCC-SMCs內(nèi)CAN活性及鈣離子內(nèi)流預(yù)防和治療動脈硬化性閉塞證。第二部分溫陽活血法抑制高磷誘導(dǎo)的兔主動脈平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化目的:探討溫陽活血法對高磷誘導(dǎo)的兔主動脈平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。材料和方法:將兔主動脈平滑肌細(xì)胞(CCC-SMCs)分為6組:β-GP(-)組和β-GP(+)組、拆方組、全方組、維拉帕米組和空白血清組。各組細(xì)胞接受干預(yù)6d完成后,收集樣本、立即進行微量酶標(biāo)法測定ALP活性。各組含藥血清干預(yù)細(xì)胞3d、6d、9d后,分別使用熒光定量PCR檢測各組RUNX2及SMAD1 m RNA相對表達(dá)量。結(jié)果:微量酶標(biāo)法測定兔主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)ALP活性,分析數(shù)據(jù)顯示,以β-GP(-)組作為陰性對照,β磷酸甘油組干預(yù)后CCC-SMCs內(nèi)ALP活力明顯上升,P0.05;以空白血清組作為陰性對照,顯示維拉帕米組、全方組、拆方組干預(yù)后對CCC-SMCs內(nèi)ALP活性具有明顯抑制作用,P0.05。實時熒光定量PCR各組提取的總RNA純度和濃度均符合實驗要求,基因RUNX2、SMAD1、GAPDH的溶解曲線為單峰,引物特異性強,無非特異性擴增和無目的基因的產(chǎn)物產(chǎn)生。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定熒光定量PCR擴增產(chǎn)物結(jié)果顯示:各基因引物擴增RUNX2、SMAD1、GAPDH基因在各組CCC-SMCs中均有表達(dá);擴增產(chǎn)物未出現(xiàn)數(shù)條條帶或拖尾現(xiàn)象,說明引物特異性強,無非特異性擴增,無引物二聚體等無目的DNA產(chǎn)生;PCR產(chǎn)物的長度與對應(yīng)目的基因的長度一致。使用2-△△CT法對各組樣品中的RUNX2、SMAD1基因進行相對定量分析。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,以β-GP(-)組作為陰性對照組進行比較,β-GP(+)組干預(yù)3d、6d、9d后RUNX2、SMAD1 m RNA的相對表達(dá)量水平均明顯增高,P0.05。全方組、拆方組、維拉帕米組以空白血清組為陰性對照,比較各組間含藥血清干預(yù)3d RUNX2 m RNA的相對表達(dá)量均無明顯差異(P0.05),3d SMAD1m RNA的相對表達(dá)量全方組、拆方組、維拉帕米組3d的SMAD1 m RNA表達(dá)量均明顯增高,P0.05。6d后全方組、拆方組、維拉帕米組的RUNX2及SMAD1 m RNA表達(dá)量均明顯下降,P0.05。干預(yù)9d后,拆方組、維拉帕米組比較空白血清組RUNX2 m RNA的相對表達(dá)量均無明顯差異,P0.05;全方組比較空白血清組RUNX2 m RNA的相對表達(dá)量下降,P0.05;9d后全方組、拆方組、維拉帕米組比較空白血清組的SMAD1 m RNA表達(dá)量均明顯下降,P0.05。小結(jié)①全方組、拆方組、維拉帕米組對CCC-SMCs內(nèi)ALP活性均有抑制作用。②全方組、拆方組、維拉帕米組對RUNX2及SMAD1 m RNA的表達(dá)具有抑制作用。③、全方組、拆方組、維拉帕米組對RUNX2及SMAD1 m RNA的表達(dá)的抑制作用隨時間改變。④、溫陽活血法可能通過抑制CCC-SMCs內(nèi)ALP活性以及RUNX2及SMAD1 m RNA的表達(dá),抑制高磷環(huán)境中CCC-SMCs向成骨細(xì)胞分化和鈣化。
【圖文】：

Flou4-Am 檢測β-GP（-）組、β-GP（+）組、空白血清（B方（Complete Recipes）組、拆方（Decomposed Recipes）組）組作用 6d后對 CCC-SMCs 熒光強度。白濃度 BCA 法檢測蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve），相關(guān)系數(shù) R2＞0.99，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線具有可行度和總蛋白濃度。表 1-4為各組總蛋白濃度，將蛋白濃

-8 比色法檢測β-GP（-）組、β-GP（+）組、空白血清（Blomplete Recipes）組、拆方（Decomposed Recipes）組及維組作用 6d后對 CCC-SMCs 內(nèi)鈣離子濃度的影響。CC-SMCs 內(nèi) CAN 活性藥血清干預(yù) 6d 后，ELISA 測定兔主動脈平滑肌細(xì)標(biāo)準(zhǔn)品曲線，R值為相關(guān)系數(shù)，R2=0.9859，表明曲有可行性。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 CAN活性（表 1-8）析數(shù)據(jù)顯示，以β-GP（-）組作為陰性對照，β磷C-SMCs內(nèi) CAN 活力明顯上升，，P＜0.05 ； 以空白，顯示維拉帕米組、全方組、拆方組干預(yù)后對 CC
【學(xué)位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2699199