發(fā)布時(shí)間：2020-06-06 04:26

【摘要】：目的:利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)研究鐵皮石斛多糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)基因表達(dá)譜的影響,同時(shí),研究黃連對(duì)人肝癌細(xì)胞(Hep G2)基因表達(dá)譜的影響。方法:1.使用旋蒸儀進(jìn)行鐵皮石斛多糖、黃連的取。2.MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。3.樣本總RNA的取與檢測(cè)。4.c DNA的合成與擴(kuò)增。5.芯片雜交。6.芯片圖像采集及掃數(shù)據(jù)分析。7.生物信息學(xué)分析。8.q RT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。9.利用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均值±方差(x±s)表示,兩組之間的差異比較采用T檢驗(yàn)。P0.05或P0.001為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)鐵皮石斛多糖對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖活性有一定的抑制作用。與對(duì)照組比較,100μg/m L以上鐵皮石斛多糖的給藥濃度越高,HUVEC細(xì)胞的存活率均顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)。高濃度的黃連粗物對(duì)Hep G2細(xì)胞的增殖活性有一定的抑制作用。與對(duì)照組相比,30μg/m L以上黃連的給藥濃度越高,Hep G2細(xì)胞的存活率均顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.基因表達(dá)譜芯片的結(jié)果400μg/m L鐵皮石斛多糖作用HUVEC細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組相比,存在表達(dá)差異的基因共91個(gè),其中上調(diào)基因(Ratio2)的有84個(gè),下調(diào)基因(Ratio0.5)的有7個(gè)。75μg/m L黃連作用Hep G2細(xì)胞24 h后,差異表達(dá)的基因共1621個(gè),其中上調(diào)基因(Ratio2)的有869個(gè),下調(diào)基因(Ratio0.5)的有752個(gè)。3.生物信息學(xué)分析對(duì)于鐵皮石斛多糖作用HUVEC細(xì)胞后,對(duì)全部的差異基因做GO富集分析,結(jié)果表明,上調(diào)差異基因功能主要富集在細(xì)胞因子的產(chǎn)生、免疫反應(yīng)及趨化因子等生物學(xué)過(guò)程,下調(diào)差異基因功能主要富集在細(xì)胞因子活性、趨化因子、免疫應(yīng)答及應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。KEGG通路分析表明鐵皮石斛多糖上調(diào)基因主要參與了TNF信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、單純皰疹病毒、麻疹、瘧疾、Toll樣受體信號(hào)通路、Nod樣受體信號(hào)通路等,而鐵皮石斛多糖下調(diào)基因主要富集在趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)通路。黃連作用Hep G2細(xì)胞后,對(duì)全部的差異基因做GO富集分析,結(jié)果表明,上調(diào)差異基因功能主要富集在細(xì)胞凋亡,蛋白質(zhì)活性等生物學(xué)過(guò)程,下調(diào)差異基因功能主要富集在細(xì)胞有絲分裂、氧化還原酶活性等生物學(xué)過(guò)程。KEGG通路分析表明黃連上調(diào)基因主要參與了p53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、癌癥相關(guān)的信號(hào)通路,而下調(diào)基因主要參與脂代謝相關(guān)的信號(hào)通路。4.q RT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果在鐵皮石斛多糖作用HUVEC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,為了驗(yàn)證芯片結(jié)果,我們根據(jù)KEGG基因功能富集的結(jié)果,從上調(diào)和下調(diào)基因中分別選取與免疫相關(guān)的代表性基因:IL6、ICAM1、CCL14基因進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證。而在黃連作用Hep G2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,從上調(diào)基因中選取與癌癥相關(guān)的代表性基因ACTG1、ITGB1,下調(diào)基因中選取與脂代謝相關(guān)的代表性基因ACAT2、HMGCS1進(jìn)行q RT-PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證的結(jié)果均與芯片的結(jié)果一致。結(jié)論:鐵皮石斛多糖作用HUVEC細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,基因表達(dá)存在明顯的差異,其中差異表達(dá)基因顯著富集在免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及趨化因子等信號(hào)通路中。黃連作用人肝癌細(xì)胞后,差異表達(dá)基因顯著富集在癌癥、脂代謝信號(hào)通路。該研究更全面的了解鐵皮石斛多糖和黃連的作用靶點(diǎn),為進(jìn)一步研究鐵皮石斛多糖和黃連的藥理作用機(jī)制供依據(jù)。
【圖文】：

1 芯片雜交熒光信號(hào)散點(diǎn)圖（紅色代表上調(diào)基因，綠色表 2 前 5 位上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因排列前 5 位） 下調(diào)基因（排列前功能 Ratio 值 基因名 功能 胞因子可刺皮細(xì)胞使白于血管內(nèi)皮，脈粥樣硬化22.77 VWCE編碼表皮生長(zhǎng)因構(gòu)域和參與炎癥19.69 CPT1A編碼的蛋白在脂謝中起作用性粒細(xì)胞，，維性12.37 CLU參與細(xì)胞凋亡，展，并與神經(jīng)變性關(guān)應(yīng)答，化學(xué)誘

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文析結(jié)果示，上調(diào)差異表達(dá)基因功能主要富集在細(xì)胞因子介因子活性等生物學(xué)過(guò)程，下調(diào)差異表達(dá)基因功能主子、免疫應(yīng)答及應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程（圖 2）。可富集于趨化因子受體、趨化因子活性、細(xì)胞因子活
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R284;R285

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