【摘要】：研究背景:影響心肌梗死(MI)預(yù)后的主要病理因素是受損心肌功能喪失,如何促進心肌細胞再生是影響預(yù)后的關(guān)鍵。已知SIRT1(Silent mating type information regulation 2 homolog-1)能在應(yīng)激條件下減少細胞凋亡,而心臟干細胞有研究證實也可分化為良好的心肌。中藥在MI治療中有著重要地位,課題組通過前期國家自然基金資助項目發(fā)現(xiàn)祛瘀生新法能調(diào)控SIRT1抑制細胞凋亡,促進干細胞修復(fù)受損心肌,但SIRT1與心臟干細胞在MI中的相關(guān)性尚無報道。目的:1.通過血府逐瘀膠囊對大鼠心肌梗死模型的干預(yù)治療,觀察其療效并揭示該療效與SIRT1表達、C-kit+/Lin-干細胞功能調(diào)節(jié)三者之間的內(nèi)在聯(lián)系。2.闡述“心肌梗死能誘使心臟干細胞增殖,SIRT1表達增多可提高心臟干細胞再生能力,祛瘀生新法則具有靶向SIRT1-心臟干細胞效應(yīng),從而實現(xiàn)共同修復(fù)缺血壞死心肌的作用”假說的科學(xué)內(nèi)涵。3.揭示基于祛瘀生新視角的血府逐疲膠囊療效機制,為防治心肌梗死提供新思路,結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)促進中醫(yī)藥應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)。方法:1.心肌梗死模型構(gòu)建:采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支方法制備心肌梗死模型。選用的大鼠為SPF級健康雄性WISTAR大鼠,200只,體重230±10g。2.實驗分組及給藥方式:共造模200只,成活104只,手術(shù)成活率為52%。按隨機數(shù)字表法將造模成功大鼠分為以下八組:模型7天組,血府逐瘀膠囊低劑量7天組,血府逐瘀膠囊中劑量7天組,血府逐瘀膠囊高劑量7天組,模型28天組,血府逐瘀膠囊低劑量28天組,血府逐瘀膠囊中劑量28天組,血府逐瘀膠囊高劑量28天組,加上假手術(shù)7天組、假手術(shù)28天組,共十組。造模后于第12h后行心電圖檢查,根據(jù)心電圖ST段抬高和I、AVL、V1-V6導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)6-8個病理性Q波數(shù)量篩選模型,判斷心梗的嚴重程度,剔除梗死程度太重或太輕的大鼠,最終納入觀察動物總數(shù)為64只。采用灌胃的方式給藥。假手術(shù)組:每日以與藥物組等容量無菌蒸餾水灌胃,模型組:每日以與藥物組等容量無菌蒸餾水灌胃,血府逐瘀膠囊低劑量組:0.216g/kg/次、2ml/次、2次/d,血府逐瘀膠囊中劑量組:0.432g/kg/次、2ml/次、2次/,血府逐疲膠囊高劑量組:0.864g/kg/次、2ml/次、2 次/d。3.心電圖檢測:分別于造模手術(shù)前,術(shù)后12h對大鼠進行心電圖檢測。4.超聲檢測:采用Vevo 770高分辨率超聲影像系統(tǒng)分別于給藥7天和28天后對7天組和28天組實驗動物進行超聲檢查。檢測指標(biāo)為左心室后壁舒張末厚度(LVPWd)、左室前壁舒張末厚度(LVAWd)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs),并計算左室短軸率(FS)、左室射血分數(shù)(EF)。5.熒光法測心肌梗死面積:采用Fx Pro型號的小動物活體成像對等厚的5片心肌組織進行熒光照射,檢測心肌梗死面積。6.TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。7.實時熒光定量PCR法檢測SIRT1、Fox01、C-kit mRNA表達。8.蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blotting)法檢測SIRT1、Bcl-xL等蛋白的表達。9.免疫組化法檢測SIRT1、Bcl-xL等蛋白的表達。10.活性氧簇測定心肌梗死后R0S釋放。結(jié)果:1.心臟超聲結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊低劑量組、血府逐瘀膠囊中劑量組LVIDd、LVIDs有減小趨勢,且血府逐瘀膠囊低劑量組LVIDd減小差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),血府逐瘀膠囊中劑量組LVIDs減小差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);心肌梗死后28天,模型組LVIDd、LVIDs比假手術(shù)組顯著增加(P0.01),與模型組相比,給藥組LVIDd、LVIDs減小差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),且與血府逐瘀膠囊中劑量組相比,血府逐瘀膠囊低劑量組LVIDs減少有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。2.心臟超聲結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組左室射血分數(shù)(EF)、左室短軸率(FS)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊低劑量組EF升高差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),血府逐瘀膠囊低劑量組、血府逐瘀膠囊中劑量組FS升高差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),且與血府逐瘀膠囊中劑量組相比,血府逐瘀膠囊低劑量組EF升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),FS升高差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);心肌梗死后28天,模型組EF、FS比假手術(shù)組顯著降低(P0.01,P0.05),與模型組相比,給藥組EF、FS有增加趨勢,且血府逐瘀膠囊低劑量組、血府逐瘀膠囊中劑量組EF、FS比模型組顯著增加(P0.01),與血府逐瘀膠囊中劑量組相比,血府逐瘀膠囊低劑量組FS升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.熒光法測心肌梗死面積結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組心肌梗死面積顯著增加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,給藥組心肌梗死面積有減小趨勢;心肌梗死后28天,模型組心肌梗死面積比假手術(shù)組顯著增加(P0.01),與模型組相比,給藥組心肌梗死面積有減小趨勢,且血府逐瘀膠囊低劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.TUNEL結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組凋亡率顯著增加(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組心肌細胞凋亡率降低且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);心肌梗死后28天,模型組凋亡率明顯增加且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組凋亡率顯著降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.心肌組織PCR結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組SIRT1、C-kit表達顯著降低(P0.01,P0.05),Fox01表達顯著增加(P0.01),給予血府逐瘀膠囊干預(yù)后,SIRT1、C-kit表達明顯增加(P0.05,P0.01),Fox01表達明顯降低(P0.01);心肌梗死后28天,模型組SIRT1、C-kit表達比假手術(shù)組顯著降低(P0.01,P0.05),Fox01表達顯著增加(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組SIRT1、C-kit表達明顯增加(P0.01),Fox01 表達明顯降低(P0.01)。6.心肌組織Bax、Bcl-xL蛋白表達結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組Bax蛋白表達顯著增加、Bcl-xL蛋白表達顯著降低且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組Bax蛋白表達明顯降低且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),Bcl-xL蛋白表達顯著增加且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);心肌梗死后28天,模型組Bax蛋白表達比假手術(shù)組顯著增加、Bcl-xL蛋白表達顯著降低且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐疲膠囊組Bax蛋白表達顯著降低、Bcl-xL蛋白表達顯著增加且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7.心肌組織Caspase-3、Fas蛋白表達結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組Caspase-3、Fas蛋白表達顯著增加并且Caspase-3蛋白表達差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)、Fas蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組Caspase-3蛋白表達降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),Fas蛋白表達顯著降低且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);心肌梗死后28天,模型組Caspase-3、Fas蛋白表達比假手術(shù)組顯著增加且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組Caspase-3、Fas蛋白表達顯著降低且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。8.心肌組織SIRT1、S0D2蛋白表達結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組SIRT1、S0D2蛋白表達明顯減少并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組SIRT1、S0D2蛋白表達顯著增加且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);心肌梗死后28天,模型組SIRT1、SOD2蛋白表達比假手術(shù)組顯著減少且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,P0.05),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組SIRT1、S0D2蛋白表達明顯增加且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。9.心肌組織Fox01、P53蛋白表達結(jié)果顯示,心肌梗死后7天,與假手術(shù)組相比,模型組Fox01蛋白表達顯著增加(P0.01)、P53蛋白表達明顯增加(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組Fox01蛋白表達減少且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)、P53蛋白表達顯著減少且(P0.01);心肌梗死后28天,模型組Fox0l、P53蛋白表達比假手術(shù)組顯著增加且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組Fox0l、P53蛋白表達顯著減少且Fox01蛋白表達減少差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)、P53蛋白表達減少差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。10.免疫組化采用測量單位光密度值(Density)的方法檢測陽性細胞的著色強度,并計算其相對光密度值,結(jié)果顯示,7天、28天各時間點模型組SIRT1、Bcl-xL染色強度降低,Fas、P53染色強度增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),給予血府逐瘀膠囊干預(yù)后,血府逐瘀膠囊組SIRT1、Bcl-xL染色強度較模型組顯著增強(P0.05),Fas、P53染色強度較模型組顯著降低(P0.05)。11.R0S測定結(jié)果顯示,心肌梗死后7天、28天各時間點,與假手術(shù)組相比,模型組R0S明顯增加(P0.01),與模型組相比,血府逐瘀膠囊組ROS顯著減少(P0.05)。結(jié)論:1.血府逐瘀膠囊通過改善心室重構(gòu),提高心功能,從而發(fā)揮其心臟保護作用。2.血府逐瘀膠囊通過抗心肌細胞凋亡,減小心肌梗死面積,從而發(fā)揮其心臟再生作用。3.血府逐瘀膠囊具有改善心室重構(gòu),抗心肌細胞凋亡作用,其機制可能與其抑制ROS生成有關(guān)。4.血府逐瘀膠囊具有抗心肌細胞凋亡,促進心臟干細胞再生的作用。5.SIRT1表達增多可提高心臟干細胞再生能力,血府逐瘀膠囊可能具有靶向SIRT1-心臟干細胞效應(yīng),從而實現(xiàn)共同修復(fù)缺血壞死心肌的作用。6.SIRT1通路可能成為保持心臟干細胞功能的潛在目標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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