【摘要】：肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)的生成和降解失衡,匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)有大量以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的纖維組織增生與沉積的病理過程。肝纖維化是各種原因引起的慢性肝病發(fā)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌的基礎(chǔ)和必經(jīng)階段,其病理改變可以逆轉(zhuǎn)。肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)被激活,轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)。HSCs位于Disse隙內(nèi),其激活和轉(zhuǎn)化受多因子和多途徑調(diào)節(jié)。本課題組前期對中藥姜黃的主要成分姜黃素的抗肝纖維化作用和分子機理進(jìn)行了大量研究,認(rèn)為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是控制HSCs活化的“開關(guān)”分子。而海洋化合物二十二碳六烯酸(DHA)是PPARγ的天然配體。因此,本論文提出DHA可以通過激活PPARγ從而抑制HSCs的活化,改善肝纖維化的科學(xué)假說。本論文首先以體內(nèi)模型研究了 DHA對肝纖維化的改善作用。以腹腔注射四氯化碳(CC14)的方法建立大鼠肝纖維化模型,造模同時給予DHA預(yù)防性治療。結(jié)果表明,DHA能夠明顯減輕大鼠肝損傷,減少肝臟膠原含量并改善肝纖維化指標(biāo)。在mRNA和蛋白兩個層面上,DHA給藥使肝纖維化大鼠肝臟PPARy表達(dá)顯著升高,同時Tβ-RI,Tβ-RII以及PDGF-βR表達(dá)降低。因此,我們推斷DHA可能通過調(diào)控HSCs中的PPARy從而抑制TGF-β和PDGF通路,改善肝纖維化。體外大鼠HSC-T6細(xì)胞系的實驗進(jìn)一步證實,DHA可以上調(diào)PPARy,阻斷TGFβ下游的Smad2/3和以及PDGF下游的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化,從而抑制HSCs活化。在此基礎(chǔ)上,本論文對DHA抑制HSCs活化進(jìn)行了機理研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DHA可以通過調(diào)控AKT/FOXO1/p27信號通路抑制HSCs增殖。同時,DHA給藥可以上調(diào)BAX,下調(diào)Bcl-2,誘導(dǎo)HSCs凋亡。拮抗PPARγ基本抵消了 DHA抑制HSCs活化的作用。因此認(rèn)為,DHA通過PPARy依賴性的機制抑制HSCs增殖的同時促進(jìn)HSCs凋亡,進(jìn)而抑制HSCs的活化。計算機分子對接結(jié)果顯示,DHA可以與PPARy結(jié)構(gòu)的活性位點之間產(chǎn)生較好的結(jié)合作用,PPARy可能是DHA的直接作用靶標(biāo)。為了驗證分子對接的結(jié)果,我們構(gòu)建了 Ser289突變的PPARy質(zhì)粒。Western Blot的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染Ser289突變的PPARy使LX-2的PPARγ蛋白表達(dá)顯著升高,但肝纖標(biāo)志蛋白a-平滑肌肌動蛋白(a-Smooth MuscleActin,a-SMA)和Fibronectin的表達(dá)卻沒有因此而降低。提示,與Ser289等氨基酸殘基形成氫鍵是DHA激活PPARγ所必須的誘導(dǎo)契合機制之一。最后,我們以小鼠肝纖維化模型驗證DHA的抗肝纖維化作用依賴于PPARγ的激活。綜上所述,本論文的研究明確了海洋化合物DHA對肝損傷具有一定的保護(hù)作用,并進(jìn)一步證明DHA可能通過激活PPARγ,抑制HSCs活化,進(jìn)而緩解肝纖維化的分子機理。本論文的研究為海洋藥物的開發(fā)提供了理論和實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2698455