【摘要】：目的:1、前期實驗表明黃連素干預(yù)胰島β細(xì)胞INS-1后,促進(jìn)了細(xì)胞胰島素分泌,而胰島素合成不變,本實驗旨在進(jìn)一步探討其中的分子機制;2、研究黃連素對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)機制。方法:1、用1640培養(yǎng)基培育胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞,分別用濃度為0μM、2.5μM、5μM、10μM的黃連素干預(yù)INS-1 48h,Western blot法檢測黃連素對PKA活性及CREB、AMPK、CRTC2磷酸化活性的影響;2、鋪6孔板培養(yǎng)細(xì)胞24h后,更換培養(yǎng)液為含有0.2%BSA的培養(yǎng)液饑餓處理8h,按照以下分組進(jìn)行干預(yù):(1)空白對照組:加入等體積等濃度的DMSO(溶質(zhì));(2)陽性對照組:加入0.5mM AICAR(AMPK激動劑)干預(yù)INS-1細(xì)胞3h;(3)陰性對照組:加入10μM Compound C(AMPK抑制劑)干預(yù)INS-1細(xì)胞3h;(4)黃連素(BBR)組:加入5μM BBR干預(yù)INS-1細(xì)胞48h;(5)BBR+AICAR組:加入5μM BBR和0.5mM AICAR干預(yù)48h;(6)BBR+Compound C組:加入5μM BBR和10μM Compound C干預(yù)48h;3、萃取細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白,Western blot法分別測定細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌相關(guān)信號通路因子AMPK、CREB的磷酸化水平及細(xì)胞核內(nèi)CRTC2含量;4、培育胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞,分別設(shè)置空白對照組、細(xì)胞因子混合物(5ng/ml IL-1β、10ng/ml TNF-α、100ng/ml IFN-γ)損傷組、黃連素(5μM)組、BBR+細(xì)胞因子混合物組,Western blot法分別測定細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量的變化以及相關(guān)因子AKT、ERK1/2、AMPK磷酸化水平和L型鈣離子通道Cav1.2的蛋白表達(dá)水平,測定凋亡相關(guān)蛋白,包括Bcl-2、Cleaved-caspase3的表達(dá)水平;5、用MTT法檢測細(xì)胞活性;6、KRB緩沖液配制低糖(2.8mM)和高糖(16.7mM)溶液進(jìn)行高糖刺激下胰島素分泌試驗(GSIS),胰島素ELISA盒測定胰島素分泌量的變化。結(jié)果:1、濃度為2.5μM、5μM、10μM黃連素作用于INS-1細(xì)胞,均明顯促進(jìn)了CREB、AMPK、CRTC2的磷酸化和PKA的活性,5μM時激活更明顯,所以本實驗后期黃連素干預(yù)濃度選擇5μM;2、Western blot結(jié)果顯示黃連素能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)CREB的磷酸化,加入cAMP/PKA通路抑制劑H-89后,其磷酸化活性被抑制,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),同時黃連素也增強了AMPK的激酶活性,繼而CRTC2 Ser171位點被磷酸化隔離在細(xì)胞質(zhì)中,加入Compound C后,AMPK磷酸化活性被抑制,CRTC2發(fā)生去磷酸化入核增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。3、與對照組相比,細(xì)胞因子混合物組INS-1細(xì)胞中NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)運含量增加,其上游相關(guān)信號因子AKT磷酸化水平也增加,加入黃連素后,AKT磷酸化水平下降,NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)運也減弱(p0.05);4、黃連素對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化活性的增加無明顯影響,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;5、黃連素逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞因子誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-2含量的下降和促凋亡蛋白caspase3的水解增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;6、細(xì)胞因子組L型鈣離子通道Cav1.2表達(dá)下降,而加入黃連素后其表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。7、MTT結(jié)果顯示細(xì)胞因子混合物組細(xì)胞活性明顯降低,而加入BBR以后,細(xì)胞活性未明顯改善(p0.05);8、GSIS試驗結(jié)果顯示:細(xì)胞因子明顯降低了INS-1細(xì)胞高糖刺激下的胰島素分泌,而加入黃連素后胰島素分泌量有所增加,但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:結(jié)合前期實驗結(jié)果,黃連素同時激活cAMP/PKA/CREB通路和AMPK/CRTC2通路共同調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能;黃連素通過抑制AKT的磷酸化活性和促進(jìn)AMPK磷酸化活性抑制NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)運保護(hù)INS-1細(xì)胞免受細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥損傷,黃連素可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-2含量的下降和促凋亡蛋白caspase3的水解增加發(fā)揮抗凋亡作用;細(xì)胞因子通過抑制Cav1.2表達(dá)使INS-1細(xì)胞胰島素分泌降低,而黃連素可以逆轉(zhuǎn)Cav1.2的表達(dá)。
【圖文】：

學(xué)碩士學(xué)位論文 二、黃連素對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島 β 細(xì)胞損傷 2.1 所示：與空白對照組相比，，細(xì)胞因子混合物組細(xì)胞核異有統(tǒng)計學(xué)意義（*p<0.05），當(dāng)加入黃連素后細(xì)胞核內(nèi) NF統(tǒng)計學(xué)意義（# 與細(xì)胞因子混合物組相比，p<0.05），說B 的入核；另外我們還發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，單純黃連明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），而黃連素和細(xì)的實驗組 NF-κB 的入核相對于細(xì)胞因子混合物組明顯減（# 與細(xì)胞因子混合物組相比，p<0.05）；說明黃連素可炎作用，保護(hù) INS-1 細(xì)胞免受炎癥因子的損傷。如圖 2.1

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 二、黃連素對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的胰島 β 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用為了進(jìn)一步探究 NF-κB 與 AKT 的磷酸化水平是否直接相關(guān)，我們加入了 AKT抑制劑 KP372-1，發(fā)現(xiàn) NF-κB 的入核同樣減少，如圖所示，KP372-1 與細(xì)胞因子混合物組細(xì)胞核內(nèi) NF-κB 含量減少（#與細(xì)胞因子混合物組相比，p<0.05），所以我們猜測黃連素可能通過抑制 AKT 的磷酸化水平從而抑制 NF-κB 的核內(nèi)轉(zhuǎn)運。如圖 2.2 所示。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Pranav Kumar Prabhakar;Mukesh Doble;;Mechanism of Action of Natural Products Used in the Treatment of Diabetes Mellitus[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2011年08期

本文編號：2697177