【摘要】：目的:1、前期實驗表明黃連素干預胰島β細胞INS-1后,促進了細胞胰島素分泌,而胰島素合成不變,本實驗旨在進一步探討其中的分子機制;2、研究黃連素對細胞因子誘導的胰島β細胞炎癥損傷的保護機制。方法:1、用1640培養(yǎng)基培育胰島素瘤細胞系INS-1細胞,分別用濃度為0μM、2.5μM、5μM、10μM的黃連素干預INS-1 48h,Western blot法檢測黃連素對PKA活性及CREB、AMPK、CRTC2磷酸化活性的影響;2、鋪6孔板培養(yǎng)細胞24h后,更換培養(yǎng)液為含有0.2%BSA的培養(yǎng)液饑餓處理8h,按照以下分組進行干預:(1)空白對照組:加入等體積等濃度的DMSO(溶質);(2)陽性對照組:加入0.5mM AICAR(AMPK激動劑)干預INS-1細胞3h;(3)陰性對照組:加入10μM Compound C(AMPK抑制劑)干預INS-1細胞3h;(4)黃連素(BBR)組:加入5μM BBR干預INS-1細胞48h;(5)BBR+AICAR組:加入5μM BBR和0.5mM AICAR干預48h;(6)BBR+Compound C組:加入5μM BBR和10μM Compound C干預48h;3、萃取細胞核和細胞漿蛋白,Western blot法分別測定細胞內胰島素分泌相關信號通路因子AMPK、CREB的磷酸化水平及細胞核內CRTC2含量;4、培育胰島素瘤細胞系INS-1細胞,分別設置空白對照組、細胞因子混合物(5ng/ml IL-1β、10ng/ml TNF-α、100ng/ml IFN-γ)損傷組、黃連素(5μM)組、BBR+細胞因子混合物組,Western blot法分別測定細胞核內NF-κB含量的變化以及相關因子AKT、ERK1/2、AMPK磷酸化水平和L型鈣離子通道Cav1.2的蛋白表達水平,測定凋亡相關蛋白,包括Bcl-2、Cleaved-caspase3的表達水平;5、用MTT法檢測細胞活性;6、KRB緩沖液配制低糖(2.8mM)和高糖(16.7mM)溶液進行高糖刺激下胰島素分泌試驗(GSIS),胰島素ELISA盒測定胰島素分泌量的變化。結果:1、濃度為2.5μM、5μM、10μM黃連素作用于INS-1細胞,均明顯促進了CREB、AMPK、CRTC2的磷酸化和PKA的活性,5μM時激活更明顯,所以本實驗后期黃連素干預濃度選擇5μM;2、Western blot結果顯示黃連素能夠促進細胞內CREB的磷酸化,加入cAMP/PKA通路抑制劑H-89后,其磷酸化活性被抑制,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),同時黃連素也增強了AMPK的激酶活性,繼而CRTC2 Ser171位點被磷酸化隔離在細胞質中,加入Compound C后,AMPK磷酸化活性被抑制,CRTC2發(fā)生去磷酸化入核增多,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3、與對照組相比,細胞因子混合物組INS-1細胞中NF-κB核內轉運含量增加,其上游相關信號因子AKT磷酸化水平也增加,加入黃連素后,AKT磷酸化水平下降,NF-κB核內轉運也減弱(p0.05);4、黃連素對細胞因子誘導的ERK1/2磷酸化活性的增加無明顯影響,差異無統(tǒng)計學意義;5、黃連素逆轉了細胞因子誘導的抗凋亡蛋白Bcl-2含量的下降和促凋亡蛋白caspase3的水解增加,差異有統(tǒng)計學意義;6、細胞因子組L型鈣離子通道Cav1.2表達下降,而加入黃連素后其表達上升,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。7、MTT結果顯示細胞因子混合物組細胞活性明顯降低,而加入BBR以后,細胞活性未明顯改善(p0.05);8、GSIS試驗結果顯示:細胞因子明顯降低了INS-1細胞高糖刺激下的胰島素分泌,而加入黃連素后胰島素分泌量有所增加,但無明顯統(tǒng)計學差異。結論:結合前期實驗結果,黃連素同時激活cAMP/PKA/CREB通路和AMPK/CRTC2通路共同調節(jié)胰島β細胞功能;黃連素通過抑制AKT的磷酸化活性和促進AMPK磷酸化活性抑制NF-κB的核內轉運保護INS-1細胞免受細胞因子誘導的炎癥損傷,黃連素可以逆轉細胞因子誘導的抗凋亡蛋白Bcl-2含量的下降和促凋亡蛋白caspase3的水解增加發(fā)揮抗凋亡作用;細胞因子通過抑制Cav1.2表達使INS-1細胞胰島素分泌降低,而黃連素可以逆轉Cav1.2的表達。
【圖文】：

學碩士學位論文 二、黃連素對細胞因子誘導的胰島 β 細胞損傷 2.1 所示：與空白對照組相比，，細胞因子混合物組細胞核異有統(tǒng)計學意義（*p<0.05），當加入黃連素后細胞核內 NF統(tǒng)計學意義（# 與細胞因子混合物組相比，p<0.05），說B 的入核；另外我們還發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，單純黃連明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05），而黃連素和細的實驗組 NF-κB 的入核相對于細胞因子混合物組明顯減（# 與細胞因子混合物組相比，p<0.05）；說明黃連素可炎作用，保護 INS-1 細胞免受炎癥因子的損傷。如圖 2.1

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 二、黃連素對細胞因子誘導的胰島 β 細胞損傷的保護作用為了進一步探究 NF-κB 與 AKT 的磷酸化水平是否直接相關，我們加入了 AKT抑制劑 KP372-1，發(fā)現(xiàn) NF-κB 的入核同樣減少，如圖所示，KP372-1 與細胞因子混合物組細胞核內 NF-κB 含量減少（#與細胞因子混合物組相比，p<0.05），所以我們猜測黃連素可能通過抑制 AKT 的磷酸化水平從而抑制 NF-κB 的核內轉運。如圖 2.2 所示。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 Pranav Kumar Prabhakar;Mukesh Doble;;Mechanism of Action of Natural Products Used in the Treatment of Diabetes Mellitus[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2011年08期

本文編號：2697177