【摘要】：背景近幾十年,腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)的發(fā)病率呈現(xiàn)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率中僅次于膀胱癌,居第二位。目前,腎癌缺乏早期的診斷標(biāo)志,晚期和轉(zhuǎn)移后的腎細(xì)胞癌對(duì)放療和化療均不敏感。因此尋找更多具有臨床應(yīng)用價(jià)值的藥物提高患者的生存率和生活質(zhì)量是十分有意義的,也是RCC在分子免疫方面的研究熱點(diǎn)之一。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移步驟復(fù)雜、環(huán)節(jié)眾多,該過(guò)程中所涉及的分子機(jī)制為抑制其侵襲轉(zhuǎn)移提供了靶點(diǎn)。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指在特定的生理和病理情況下,上皮細(xì)胞在某些作用的驅(qū)動(dòng)下,極性喪失,細(xì)胞間的相互作用力下降,細(xì)胞向具有更強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力的間質(zhì)型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的。EMT在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演了重要角色,腫瘤細(xì)胞的EMT的程度直接決定了腫瘤的惡性程度。EMT最顯著的特征是上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量下調(diào),同時(shí)N-cadherin間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白和有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)。EMT可通過(guò)不同的信號(hào)通路如Notch、Wnt等通路激活,這些分子通路受到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的調(diào)控來(lái)誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。因此,我們預(yù)測(cè)通過(guò)調(diào)控參與EMT發(fā)生過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子可以達(dá)到預(yù)防或抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的目的。川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖,具有活血行氣、祛風(fēng)止痛、行氣開(kāi)郁等諸多功效。川芎嗪(Tetramethyipyrazine,TMP)是從川芎根莖中分離的藥理活性成分之一,長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療缺血性腦中風(fēng)和心血管疾病。除此之外,川芎嗪還具有對(duì)抗自由基,改善微循環(huán)等藥理作用。越來(lái)越多的研究證實(shí)川芎嗪對(duì)肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤也具有一定的治療作用。2013年,黃琦等通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可有效改善腎間質(zhì)纖維化,其機(jī)制可能是川芎嗪通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的p-Smad2蛋白以及α-SMA蛋白表達(dá)的上調(diào),從而抑制Smad2的活化,阻斷上皮細(xì)胞間充質(zhì)的轉(zhuǎn)分化(EMT)。另有研究證實(shí),川芎嗪可通過(guò)上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平,下調(diào)N-cadherin的蛋白表達(dá),逆轉(zhuǎn)EMT的過(guò)程,達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的治療目的。鑒于此,我們?cè)噲D以腎癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的EMT機(jī)制為切入點(diǎn),嘗試探討川芎嗪對(duì)腎癌細(xì)胞的作用及發(fā)揮抑制作用的分子機(jī)制,為臨床抗腎癌藥物的研究提供有價(jià)值的新靶點(diǎn)。目的研究川芎嗪對(duì)腎癌A498細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,并對(duì)川芎嗪發(fā)揮作用的分子機(jī)制做初步探討。方法本課題分為三大部分。第一部分,川芎嗪對(duì)腎癌A498細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。采用MTT方法檢測(cè)川芎嗪對(duì)A498細(xì)胞增殖能力的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)觀察不同川芎嗪藥物濃度組對(duì)A498細(xì)胞周期的影響;以平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)川芎嗪對(duì)A498細(xì)胞克隆能力的影響;以Trans-well細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪對(duì)A498細(xì)胞遷移能力的作用;以Trans-well細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪對(duì)A498細(xì)胞侵襲能力的影響。第二部分,川芎嗪對(duì)裸鼠體內(nèi)腎癌A498細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。首先我們將A498細(xì)胞接種至裸鼠皮下,構(gòu)建裸鼠皮下荷瘤模型,通過(guò)與對(duì)照組比較觀察川芎嗪對(duì)裸鼠皮下移植瘤增殖能力的影響;其次,我們采用裸鼠尾靜脈注射A498細(xì)胞的方法建立A498細(xì)胞在肺內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型,通過(guò)與對(duì)照組比較檢測(cè)川芎嗪對(duì)A498細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。第三部分,川芎嗪對(duì)腎癌A498細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的分子機(jī)制的研究。EMT在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演了重要角色,為了進(jìn)一步探究川芎嗪對(duì)腎癌A498細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的分子機(jī)制,我們通過(guò)Western blot方法檢測(cè)川芎嗪對(duì)腎癌細(xì)胞EMT機(jī)制發(fā)生過(guò)程中N-cadherin、Snail和Slug三個(gè)標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果在第一部分的實(shí)驗(yàn)中MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明川芎嗪可對(duì)A498細(xì)胞發(fā)揮抑制作用,該作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性;Trans-well細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川芎嗪可抑制A498細(xì)胞的遷移和侵襲作用,該作用同樣呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性。第二部分,裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示川芎嗪藥物處理組裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)速度慢于對(duì)照組,且腫瘤體積小于對(duì)照組,說(shuō)明川芎嗪可抑制A498細(xì)胞在裸鼠皮下的腫瘤生長(zhǎng)速度;在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤形成的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射對(duì)照組細(xì)胞組裸鼠100%形成了肺部轉(zhuǎn)移瘤,川芎嗪處理組小鼠僅有37.5%形成肺部轉(zhuǎn)移瘤,且腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯低于對(duì)照組,說(shuō)明川芎嗪可抑制A498細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移作用。第三部分,Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組各組N-cadherin、Snail和Slug蛋白的表達(dá)均受到了抑制,且隨著藥物濃度和時(shí)間的增加,抑制作用越明顯。由此得出結(jié)論:川芎嗪可通過(guò)抑制N-cadherin、Snail和Slug三種蛋白的表達(dá),對(duì)A498細(xì)胞EMT機(jī)制發(fā)揮抑制作用,從而抑制A498細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明川芎嗪抑制腎透明細(xì)胞癌A498細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞遷移和侵襲能力,說(shuō)明川芎嗪可以抑制腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和形成遠(yuǎn)端病灶的能力。此外,在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過(guò)裸鼠皮下種植瘤模型和尾靜脈注射體內(nèi)成瘤模型,我們發(fā)現(xiàn)川芎嗪小鼠給藥處理后,可以明顯的抑制裸鼠皮下成瘤及其體內(nèi)轉(zhuǎn)移的能力,結(jié)果同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。Western blot結(jié)果可知,隨著給藥濃度和時(shí)間的增加,川考嗪抑制了 N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá),抑制EMT發(fā)生從而抑制腎透明細(xì)胞癌的增殖、轉(zhuǎn)移和形成遠(yuǎn)端病灶。
【圖文】：

Ａ４９８細(xì)胞與不同濃度的川芎嗪作用不同時(shí)間后，，采用ＭＴＴ比色法測(cè)各組在逡逑５７０ｎｍ處的ＯＤ值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生存率（＞0．２ｍｇ／ｍＬ）逡逑與對(duì)照組之間存在顯著性差異（ｐ＜邋０．０５），各處理組能有效的抑制Ａ４９８細(xì)胞的逡逑增殖，該抑制作用在作用時(shí)間和藥物劑量上均呈現(xiàn)出依賴(lài)性（ｐ＜邋０．０５）。當(dāng)川芎逡逑嗪的藥物濃度l挘插澹恚紓恚淌�，Ａ４９Ｚs赴腦鮒襯芰γ揮斜幌災(zāi)種疲ǎ皰澹懼澹埃埃擔(dān)�，辶x霞詞寡映ぷ饔檬奔湟參醇饗緣囊種譜饔謾４ㄜ亨鶴饔糜冢粒矗梗趕赴玻矗韜笙赴義系拇婊盥史直鷂澹梗福

本文編號(hào)：2697257