【摘要】：目的:本文采用油酸(oleic acid,OA)誘導(dǎo)的LO2細胞和HepG2細胞制備非酒精性脂肪肝(NAFLD)細胞模型,通過檢測委陵菜積雪草酸對非酒精性脂肪肝細胞中脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及對脂肪生成信號通路AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS表達的影響,以此探討委陵菜積雪草酸(asiatic acid from potentilla chinensis,AAPC)對非酒精性脂肪肝細胞脂質(zhì)代謝的影響及作用機制。方法:1.非酒精性脂肪肝細胞模型的建立以人肝細胞LO2細胞和HepG2細胞為研究對象,給予不同濃度的OA培養(yǎng)24 h,MTT法測定細胞活性,結(jié)合油紅O染色、細胞內(nèi)甘油三酯(TG)及細胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)的測定,篩選制備NAFLD細胞模型的最佳OA濃度。2.AAPC對NAFLD細胞脂質(zhì)代謝的影響MTT法檢測AAPC對LO2和HepG2細胞的半數(shù)抑制率(IC_(50))。0.5mmol/L OA與不同濃度AAPC作用于細胞后,MTT法觀察細胞的增殖;隨后將細胞分為5組:正常對照組,模型組,AAPC低、中、高劑量組。AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測AAPC對細胞凋亡的影響;油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂滴形成情況;試劑盒檢測細胞TG、游離脂肪酸(FFAs)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、LDH的含量;試劑盒檢測各組細胞氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的活力;RT-PCR法檢測SREBP-1c、FAS、LXRα、TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平;免疫組化法檢測SREBP-1c蛋白的表達;免疫熒光檢測FAS、ACC1蛋白的表達;Western blot法檢測SREBP-1c、FAS、LXRα、AMPK、p-AMPK、ACC1、BAX、BCL2、NF-κBp65蛋白的表達。結(jié)果:1.非酒精性脂肪肝細胞模型的建立MTT結(jié)果顯示,OA對LO2和HepG2細胞增殖有抑制作用,且呈濃度依賴性(P0.01)。0.5 mmol/L OA刺激細胞后,油紅O染色結(jié)果顯示模型組細胞內(nèi)紅色脂滴明顯增多,此外,模型組細胞內(nèi)TG、LDH含量較正常對照組顯著升高(P0.05或P0.01),呈濃度依賴性,表明0.5 mmol/L是OA制備NAFLD細胞模型的較適宜濃度。2.AAPC對NAFLD細胞脂質(zhì)代謝的影響(1)AAPC對細胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示,AAPC對LO2和HepG2細胞增殖有抑制作用,且呈濃度依賴性(P0.01),IC_(50)分別為98.182、71.070μmol/L。同時,AAPC對脂肪變性細胞有抑制作用,呈濃度依賴性(P0.01)。與正常組比較,模型組、AAPC低、中、低劑量組細胞調(diào)亡率、細胞形態(tài)學(xué)無明顯改變。(2)AAPC對脂肪變性細胞脂質(zhì)沉積的影響油紅O染色結(jié)果顯示:模型組細胞內(nèi)見大量紅色脂滴,而AAPC低、中、高劑量組脂滴數(shù)量都有所下降。此外,與正常對照組比較,模型組細胞內(nèi)TG、FFAs、LDL含量水平顯著升高(P0.01),細胞內(nèi)HDL含量明顯下降(P0.01),經(jīng)低、中、高劑量AAPC預(yù)處理細胞24 h后,再以O(shè)A誘導(dǎo)造模,細胞內(nèi)TG、FFAs、LDL含量明顯降低(P0.05或P0.01),而細胞內(nèi)HDL含量明顯上升(P0.05或P0.01)。結(jié)果提示,AAPC能明顯降低脂質(zhì)沉積,可能是其抑制非酒精性脂肪肝的重要機制之一。(3)AAPC對脂肪變性細胞肝損傷相關(guān)酶的影響與正常對照組比較,模型組細胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH的水平顯著升高(P0.01),經(jīng)低、中、高劑量AAPC預(yù)處理細胞24 h后,再以O(shè)A誘導(dǎo)造模,細胞上清液中AST、ALT、LDH含量明顯降低(P0.01),結(jié)果提示,AAPC能降低脂肪變性細胞內(nèi)酶的含量,從而減輕肝細胞損傷程度。(4)AAPC對脂肪變性細胞氧化應(yīng)激的影響與正常對照組比較,模型組細胞內(nèi)MDA含量顯著升高(P0.01),細SOD活力明顯下降(P0.01),經(jīng)低、中、高劑量AAPC預(yù)處理細胞24 h后,再以O(shè)A誘導(dǎo)造模,細胞內(nèi)MDA含量顯著降低(P0.01),SOD活力明顯上升(P0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型組中TNF-α和IL-6 mRNA的表達顯著增多(P0.05或P0.01),AAPC能顯著下調(diào)肝脂肪變性細胞TNF-α和IL-6 mRNA的表達(P0.05或P0.01)。Western Blot結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組中NF-κBp65的表達顯著增加(P0.01),AAPC能顯著降低脂肪變性細胞NF-κBp65的表達(P0.01)。結(jié)果提示,AAPC可能通過抑制NF-κB信號通路繼而減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而改善脂質(zhì)代謝過程。(5)AAPC對脂肪變性細胞AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS信號通路的影響PT-PCR結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型組中SREBP-1c、FAS、LXRαmRNA表達顯著增多(P0.05或P0.01);AAPC能顯著下調(diào)肝脂肪變性細胞SREBP-1c、FAS、LXRαmRNA的表達(P0.05或P0.01)。免疫組化結(jié)果顯示,模型組細胞內(nèi)SREBP-1c陽性染色細胞增多濃染,在AAPC低、中、高劑量組中可見陽性表達顆粒明顯減少及棕色變淺。Western Blot和免疫熒光染色結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組中SREBP-1c、FAS、LXRα、ACC1的表達顯著增加(P0.01),AMPK和p-AMPK的表達顯著減少(P0.01),BAX和BCL2的表達無明顯變化,AAPC能顯著降低脂肪變性細胞SREBP-1c、FAS、LXRα、ACC1的表達(P0.05或P0.01),升高AMPK和p-AMPK的表達(P0.05或P0.01)對BAX和BCL2的表達無明顯變化。結(jié)果提示,AAPC對AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS信號通路具有明顯的抑制作用,這可能是其改善非酒精性脂肪肝脂質(zhì)代謝紊亂的重要分子機制之一。結(jié)論:委陵菜積雪草酸通過降低脂質(zhì)沉積來改善油酸誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝細胞脂質(zhì)代謝的作用,其機制可能與減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及抑制AMPK/LXRα/SREBP-1c/ACC1/FAS信號通路有關(guān)。
【圖文】：

Table 1-2 The effects of OA on proliferation in HepG2 cells（ x s，n=6 ）組別 濃度（mmol/L） 抑制率（%）正常對照組 - -OA 0.125 3.123 0.578OA 0.25 3.370 2.506OA 0.5 4.360 3.050*OA 1 85.296 2.590**注：與正常對照組比較，*P<0.05，，**P<0.013.2 不同濃度 OA 作用下細胞內(nèi)脂滴形成情況3.2.1 不同濃度 OA 作用下 LO2 細胞內(nèi)脂滴形成情況實驗結(jié)果顯示，正常對照組的 LO2 細胞核大，核膜完整，細胞內(nèi)未見紅色脂滴；0.25 mmol/L、0.5 mmol/L 的 OA 誘導(dǎo)后細胞漿內(nèi)均有紅色脂滴，脂滴和脂質(zhì)含量隨著 OA 濃度的增大而增加，呈濃度依賴性，說明肝脂肪變性細胞模型建立成功。結(jié)果如圖 1-1，表 1-3 所示。

2018 屆碩士研究生學(xué)位論文 委陵菜積雪草酸對非酒精性脂肪肝細胞脂質(zhì)代謝的影響及作用機制研究實驗結(jié)果顯示，正常對照組的 HepG2 細胞邊緣清晰，核膜完整，細胞內(nèi)未見紅色脂滴。0.25 mmol/L、0.5 mmol/L 的 OA 誘導(dǎo)后細胞漿內(nèi)均有紅色脂滴，脂滴和脂質(zhì)含量隨著 OA 濃度的增大而增加，且呈濃度依賴性，說明肝脂肪變性細胞模型建立成功。結(jié)果如圖 1-2，表 1-4 所示。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2695879