【摘要】：目的:1.完善hiPSC誘導為肝樣細胞的培養(yǎng)技術(shù)2.建立hiPSC誘導而來的肝樣細胞的氧化損傷模型3.探討中藥單體龍膽苦苷及黃芩素對于hiPSC誘導而來的肝樣細胞的氧化損傷模型的肝保護作用方法:1.hiPSC誘導分化為肝細胞:在分化前,將ips細胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠包被后的涂層培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)液為hiPSC培養(yǎng)液。開始誘導分化:使用細胞因子4步驟誘導分化方法:第1階段8天,hiPSC分化為內(nèi)胚層細胞的誘導,即在人iPSCs中加入100 ng/mL激活素 A(Activin A)、10 ng/mL 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(bone morphogenetic proteins-4.BMP-4)、20 ng/mL 成纖維生長因子-2(Fibroblast growth factor-2.FGF-2)、2%B27和1640細胞培養(yǎng)液;第2階段5天,為內(nèi)胚層細胞向類肝細胞的分化,即加入20 ng/mL BMP-4、10 ng/mL FGF-2、2%B27和1640細胞培養(yǎng)液;第3階段5天,類肝細胞的擴增,即加入20 ng/mL肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor.HGF)、2%B27和1640細胞培養(yǎng)液;第4階段5天,類肝細胞的成熟,加入HCM和20ng/mL制瘤素M(Oncostatin M)。期間,用倒置熒光顯微鏡觀察人iPSCs的誘導過程中第0、3,12,23天的細胞形態(tài)變化,觀察人iPSCs誘導類肝細胞是否具有肝細胞的形態(tài);用激光共聚焦技術(shù)檢測iPSCs及肝細胞標志蛋白:GATA4、HNF-4α、AFP、ALB、P450的蛋白表達,以鑒定整個誘導過程。2.肝樣細胞氧化模型造模方法:使用L0-2細胞作為預(yù)實驗以確定H2O2氧化損傷造模時的用量,將處于對數(shù)期生長的L0-2細胞消化后以7000個每孔接種于96孔板中,待24小時貼壁后分別加入用RPMI1640-FBS培養(yǎng)基稀釋成10組不同濃度的H2O2工作液(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μmol/L),以及0μmol/L的對照組,共計11組,每組設(shè)4個復(fù)孔。在造模24 h后,MTT檢測其生存率以計算H2O2的IC50用量。將該用量加入誘導成功的肝樣細胞中,檢測對其細胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)及丙二醛(MDA)的含量和細胞上清中谷丙氨酸轉(zhuǎn)移酶ALT、及谷草氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)水平的影響。3.中藥單體龍膽苦苷對于H2O2誘導的肝樣細胞氧化損傷模型的肝保護作用研究預(yù)實驗使用LO-2以確定龍膽苦苷的有效作用范圍。取已成功誘導的肝樣細胞,加入300 μ mol/L的H2O2制作氧化模型。在造模24 h后,棄上清,加入4個濃度的龍膽苦苷溶液,其中設(shè)置對照組不造模不加龍膽苦苷,設(shè)置造模組不加龍膽苦苷,以檢測氧化損傷造模24h龍膽苦苷的治療作用。從肝保護相關(guān)生物標志物血清丙氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、及丙二醛(MDA)等變化考察龍膽苦苷對肝的保護作用機制。4.中藥單體黃芩素對于H2O2誘導的肝樣細胞氧化損傷模型的肝保護作用研究預(yù)實驗使用LO-2以確定黃芩素的有效作用范圍。取已成功誘導的肝樣細胞,棄上清,加入不同劑量濃度的黃芩素溶液,加入黃芩素2h后,棄上清,加入300 μ mol/L H2O2制作氧化模型,其中設(shè)置對照組不造模不加黃芩素,設(shè)置造模組不加黃芩素。并于24 h后收集細胞。實驗重復(fù)三次,以檢測黃芩素的預(yù)防作用。取已成功誘導的肝樣細胞,加入300 μ mol/L的H2O2制作氧化模型。在造模24h后,棄上清,加入4個濃度的龍膽苦苷溶液,其中設(shè)置對照組不造模不加龍膽苦苷,設(shè)置造模組不加龍膽苦苷,以檢測黃芩素對于氧化損傷的肝樣細胞模型的預(yù)防作用。并檢測SOD、MDA、ALT、AST結(jié)果:1、人iPSCs誘導肝樣細胞分化過程中的細胞形態(tài)變化:可見在開始誘導的第一天,細胞仍然保持iPS的形態(tài),既成集落生長,細胞小且圓,密集生長,集團邊緣明顯。在第一階段誘導結(jié)束的第八天,可見細胞集團邊緣散開,細胞變大且不在呈圓形,而是類似橢圓形。在第二階段誘導結(jié)束的第十三天,5倍鏡下已完全無法看到細胞集落邊緣,細胞完全散開,20倍鏡下可見細胞間隙變大,細胞大小不一,細胞核小。在第三階段誘導結(jié)束的第十八天,5倍鏡下可見細胞變大,20倍鏡下可見細胞形狀同一,間隙變大且大小相似。在第四階段誘導結(jié)束的第二十三天,5倍鏡下可見細胞排列整齊,20倍鏡下可見細胞大小形狀基本一致且與正常人肝細胞的形態(tài)學特征相似,既呈多角形,核大且圓。免疫細胞化學染色結(jié)果:在誘導過程的第8天,內(nèi)胚層標記蛋白GATA表達。在誘導過程的第13天,標記蛋白HNF-4 α表達,標志著細胞在向肝細胞分化譜系在體外的分化。在誘導過程的第18天,標記蛋白AFP表達,這是肝祖細胞的另一個重要指標,通常原始的肝細胞中表達。在誘導過程的第23天,標記蛋ALB、P450表達,這表明細胞具有分泌和解毒的功能。從結(jié)果看細胞的分化各個階段的誘導過程準確無誤,誘導的肝細胞已經(jīng)成熟。在不同階段的不同視野內(nèi)統(tǒng)計標記蛋白及核蛋白的表達量可計算誘導成功率超過85%。2.使用H202誘導LO-2細胞氧化損傷的劑量可以使用在肝樣細胞氧化損傷造模中,并可以時肝樣細胞表現(xiàn)出氧化損傷時表現(xiàn)出的多種酶系含量變化。3.龍膽苦苷作用于H2O2誘導的肝樣細胞氧化損傷模型的治療時,可對于細胞內(nèi)ALT,AST有不同程度的降低,其中ALT呈濃度依賴式降低,而AST對濃度的依賴并不明顯。SOD有不同程度的升高,MDA有不同程度降低,對濃度的依賴同樣不明顯,說明龍膽苦苷對于iPSC誘導的肝樣細胞氧化損傷模型有治療作用。4.黃芩素作用于預(yù)防H2O2誘導的肝樣細胞氧化損傷模型時,對于細胞內(nèi)的ALT,AST有不同程度的降低,且呈濃度依賴性,說明黃芩素對肝細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性保護的效果較好;SOD有不同程度的升高且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性,MDA有不同程度降低,說明黃芩素可提高肝細胞對氧化自由基的清除率。說明黃芩素對于iPSC誘導的肝樣細胞氧化損傷模型有預(yù)防作用。結(jié)論:1.hiPSCs使用因子四步誘導分化方法可以將人誘導多能干細胞誘導分化成肝樣細胞,成功分化的細胞具有肝細胞的形態(tài)可表達重要的肝細胞蛋白。2.H2O2可作為肝樣細胞的氧化損傷模型誘導劑。3.龍膽苦苷及黃芩素對于H2O2誘導的肝樣細胞氧化損傷模型有治療及預(yù)防作用,其機制為清除氧化自由基,阻止細胞膜的破壞。
【圖文】：

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【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2695555