【摘要】：研究目的研究水溶性番茄濃縮物(Water soluble tomato concentrate,WSTC)抗血小板聚集效應(yīng)。研究背景心血管疾病,特別是血栓性疾病,嚴(yán)重危害人們的生命與健康。血小板的活化和聚集在生理止血過(guò)程和血栓形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。生理?xiàng)l件下,血管損傷部位的血小板活化促進(jìn)止血;然而,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或血流紊亂區(qū)域的血小板過(guò)度活化則可導(dǎo)致血栓形成,誘發(fā)急性心肌梗死和缺血性中風(fēng)等疾病。研究表明糖尿病患者、久坐人群、肥胖和胰島素抵抗等人群的血小板聚集活性增高或在活化劑作用下表現(xiàn)出過(guò)度反應(yīng)的狀態(tài)。臨床上應(yīng)用抗血小板藥物如阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛等對(duì)于心腦血管疾病二級(jí)防治具有重要意義。然而,抗血小板聚集藥物在影響血小板功能的同時(shí)也會(huì)伴隨出血時(shí)間延長(zhǎng)的現(xiàn)象,這對(duì)于心血管風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低人群的一級(jí)預(yù)防可能并不適合。因此,尋找更安全的抗血小板物質(zhì)從而抑制血小板過(guò)度活化,對(duì)于預(yù)防心血管疾病具有非常重要的意義。番茄(Lycopersicon esculentum)含有多種有益于人體健康的成分,包括維生素E、類黃酮、植物甾醇、類胡蘿卜素、多種水溶性維生素和礦物質(zhì)等多種對(duì)人體有益的成分。WSTC是從成熟的番茄中提取而得,含有核苷類、酚類和黃酮類等成分。國(guó)外臨床試驗(yàn)研究表明WSTC可影響人血小板活性,抑制血小板聚集,但其抗血小板聚集的分子機(jī)制尚不清楚。本研究采用激光比濁法,分別探究體外血小板孵育WSTC以及動(dòng)物口服WSTC后對(duì)血小板聚集的影響;采用普利生半自動(dòng)血凝儀C2000,考察WSTC對(duì)正常大鼠凝血功能的影響;以Calcein AM熒光標(biāo)記血小板,通過(guò)血小板與纖維蛋白原結(jié)合實(shí)驗(yàn),研究WSTC對(duì)血小板GPⅡb/Ⅲa的活化作用;采用Western blot法研究WSTC對(duì)血小板PI3K、PDI、PECAM-1及骨架蛋白β1-tubulin表達(dá)影響,探究WSTC抑制血小板聚集可能的作用機(jī)制。研究?jī)?nèi)容1.WSTC體外抗大鼠血小板聚集研究雄性SD大鼠,戊巴比妥鈉(50mg·kg-1)麻醉,腹主動(dòng)脈取血,梯度離心分離制備PRP(Platelet Rich Plasma,富血小板血漿),將PRP分別與不同濃度的WSTC(0.06 g.L-1、0.60g·L-1、6.00 g·L-1)體外 37℃孵育 5 min,以 ADP(Adenosine diphosphate,二磷酸腺苷,2.5 μmol·L-1誘導(dǎo)血小板聚集。采用比濁法,通過(guò)血小板聚集儀測(cè)定血小板的最大聚集率。2.WSTC半體外抗大鼠血小板聚集研究55只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,分別為正常組,氯吡格雷組(7.5 mg·Kg-1),WSTC低劑量組(25 mg-Kg-1),WSTC中劑量組(75 mg·Kg-1)和WSTC高劑量組(150 mg·Kg-1),每組按照1 mL·100g-1大鼠體重灌胃給藥/蒸餾水,每日1次,連續(xù)給藥4周。末次給藥2 h后麻醉取血,分離制備PRP,在ADP(2.5 μmol·L-1)誘導(dǎo)下,利用血小板聚集儀測(cè)定血小板最大聚集率。3.WSTC對(duì)正常大鼠凝血功能影響的研究55只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,分別為正常組,ASA組(Aspirin,阿司匹林,7.5mg·Kg-1),WSTC 低劑量組(150 mg·Kg-1),WSTC 中劑量組(30mg·Kg-1)和WSTC高劑量組(900mg·Kg-1),每組按照2mL 1OOg-1大鼠體重灌胃給藥/蒸餾水,每日1次,連續(xù)給藥7天。末次給藥2h后取血,制備血漿,通過(guò)半自動(dòng)凝血儀測(cè)定FIB(Fibrinogen,纖維蛋白原分子)含量、TT(Thrombin time,凝血酶時(shí)間)、PT(Prothrombin time,凝血酶原時(shí)間)以及 APTT(Activated partial thromboplastin time,活化部分凝血酶時(shí)間)。4.WSTC對(duì)血小板GP Ⅱb/Ⅲa活化影響的研究在黑色96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入纖維蛋白原溶液(250 μμg mL-1)100μL,于4℃C包被過(guò)夜,實(shí)驗(yàn)前用含1%BSA(Bull Serum Albumin,牛血清白蛋白)的HEPES-TYRODE(無(wú)Ca2+)緩沖液100 μL于37℃孵育1 h,封閉以消除非特異性黏附配體。正常大鼠取血后分離制備洗滌血小板,將洗滌血小板與CalceinAM(4μmol·L-1)室溫下避光孵育1 h進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記血小板與不同濃度WSTC(0.06 g·L-1、0.6 g L-1、6.00g·L-1)體外37℃避光孵育10min后,在ADP(10μmol·L-1)誘導(dǎo)下,與纖維蛋白原進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)15 min后,洗去未結(jié)合的血小板;采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定血小板熒光強(qiáng)度,進(jìn)而反映對(duì)GPⅡb/Ⅲa活化的影響。5.WSTC對(duì)血小板PI3K、PDI、PECAM-1和β1-tubulin表達(dá)影響的研究正常大鼠取血后分離制備洗滌血小板,將洗滌血小板與不同濃度WSTC(0.06g·L-1、0.60 g·L-1、6.00 g·L-1)體外37℃孵育5 min后,在ADP(10mol·L-1)誘導(dǎo)下,刺激活化血小板5 min,離心后裂解血小板,提取血小板總蛋白,用Western blot法檢測(cè) PI3K p110β、PDI、PECAM-1 和 β1-tubulin 的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.體外孵育WSTC對(duì)大鼠血小板聚集率的影響在ADP(2.5μmol·L-1)誘導(dǎo)下,6.0 g·L-1WSTC對(duì)血小板聚集的抑制作用較強(qiáng)(P0.01),平均抑制率為64.07%。WSTC體外抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集的半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.4 g·L-1。2.大鼠口服WSTC對(duì)血小板聚集率的影響WSTC(25mg·Kg-1,75mg·kg-1和150mg·Kg-1)灌胃給藥4周后,對(duì)ADP(2.5μmol·L-1)誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集具有顯著的抑制效應(yīng)。正常組血小板最大聚集率為56.29%,與正常組相比,氯吡格雷組血小板最大聚集率為2.55%,顯著抑制血小板的聚集,抑制率為 95.48%(P0.01);25mg·Kg-1,75mg·Kg-1 和 150 mg·Kg-1 的 WSTC組血小板最大聚集率分別為42.55%、44.2%、44.55%,顯著抑制血小板的聚集,平均抑制率分別為24.42%、21.48%、20.87%(P0.05)。3.WSTC對(duì)正常大鼠凝血功能的影響WSTC(150mg·Kg-1,300mg·Kg-1 和900 mg·Kg-1)灌胃給藥 4 周后,對(duì)大鼠 FIB含量沒(méi)有影響,且對(duì)PT、TT、APTT也無(wú)影響,表明WSTC對(duì)大鼠凝血功能無(wú)明顯影響。4.WSTC對(duì)血小板GP Ⅱb/Ⅲa活化的影響在ADP(10μmol·L-1)的誘導(dǎo)下,模型組血小板與纖維蛋白原結(jié)合率顯著上升,表明血小板GP Ⅱb/Ⅲa活化,且活化率為52.65%(P0.01);與模型組相比,0.60 g·L-1和6.00g·L-1 WSTC可明顯降低血小板與纖維蛋白原結(jié)合率,顯著抑制GPⅡb/Ⅲa活化,抑制率分別為17.47%和32.29%。5.WSTC 對(duì)血小板 PI3K、PDI、PECAM-1 和 β1-tubulin 表達(dá)的影響在 ADP(10μmol·L-1)誘導(dǎo)下,0.06g·L-1、0.60g·L-1、6.00g·L-1WSTC 對(duì)血小板相關(guān)蛋白的表達(dá)顯示出不同的調(diào)節(jié)作用。0.60 g·L-1 WSTC可顯著下調(diào)PI3K p110β的表達(dá),抑制率為61.0%(P0.01);6.00g·L-1WSTC可顯著下調(diào)PDI的表達(dá),抑制率為 59.0%(P0.05);0.60 g·L-1 和 6.00 g·L-1 WSTC 可顯著下調(diào) PECAM-1 表達(dá),抑制率分別為 26.0%和 38.0%(P0.05);0.60 g·L-1 和 6.00 g·L-1 WSTC 可顯著上調(diào)血小板骨架蛋白β1-tubulin表達(dá),增長(zhǎng)率均為36.0%(P0.01)。結(jié)論1.WSTC體外抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集;2.WSTC灌胃給藥可抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集,且不影響其凝血功能;3.WSTC通過(guò)抑制GP Ⅱb/Ⅲa的活化抑制血小板聚集;4.WSTC抑制血小板聚集的作用機(jī)制與調(diào)控PI3K p110β/PDI/PECAM-1相關(guān)信號(hào)通路,穩(wěn)定細(xì)胞骨架有關(guān)。
【圖文】：

圖１邋ＷＳＴＣ對(duì)ＡＤＰ誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的影響逡逑與模型組相比，“戶＜0．0丨，，ｎ＝３？逡逑

圖２邋ＷＳＴＣ灌胃給藥４周對(duì)大鼠血小板聚集的影響逡逑與正常組相比，＞＜０．０５，＂Ｐ＜０．０１；邋ｎ＝ｌｌ
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2692607