【摘要】：背景與目的:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。有兩種主要的組織學(xué)肺癌:非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。NSCLC占病例的80%以上,而SCLC的特征是細(xì)胞快速生長和侵襲性轉(zhuǎn)移�；阢K的化療是肺癌的重要治療選擇。然而,由于耐藥性的發(fā)展和相當(dāng)大的不良反應(yīng),化療的治療效果受到限制。因此,有必要尋找新的策略,盡量減少鉑類化療的上述兩個主要缺點,以逆轉(zhuǎn)肺癌對化療藥物的耐藥性�；倍▔A是一種從苦豆子中提取的喹嗪類生物堿。它具有一系列藥理特性,如抗病毒,抗炎,改善心臟功能和抗癌。2005年,中國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)批準(zhǔn)槐定堿注射液治療惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。最近,越來越多的報道表明槐定堿在許多其他惡性腫瘤中也具有抑制作用。然而,很少有報道研究槐定堿在肺癌中的腫瘤抑制作用及其在臨床肺癌治療中的作用。在本研究中,實驗組主要目的是探討槐定堿的抗腫瘤作用、槐定堿能否提高順鉑的抗腫瘤功效以及槐定堿與順鉑是否對肺癌的治療具有協(xié)同作用。最終證明槐定堿和鉑類化療的聯(lián)合治療是一種很有前景的肺癌治療方法。材料與方法:細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)用了五株肺癌細(xì)胞系,NCI-H460,NCI-H1299,A549,NCI-H446和DMS153,將所有細(xì)胞系在37℃及含有5%二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中溫育。細(xì)胞活力測試使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)以及Microplate Reader(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)在450nm紫外線吸收峰下測量實驗樣品的吸光度。集落形成實驗計數(shù)每個平板的菌落數(shù)以進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。細(xì)胞侵襲和遷移實驗測定實驗細(xì)胞在Transwell小室中的侵襲遷移能力。蛋白質(zhì)印跡實驗檢測了P53及HIPPO細(xì)胞信號通路的核心蛋白組份。此外還運(yùn)用熒光定量PCR測定了HIPPO細(xì)胞信號通路的下游靶基因表達(dá)情況。并且運(yùn)用裸鼠的異種移植實驗將處理后的肺癌細(xì)胞定植于裸鼠腹膜內(nèi),觀察瘤體的大小及做進(jìn)一步免疫組化和免疫印跡實驗。研究結(jié)果:1、槐定堿在體外抑制肺癌細(xì)胞的增殖。通過CCK-8和集落形成實驗,測定分析槐定堿對不同類型的人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。首先,CCK8實驗表明,槐定堿或順鉑單一處理組足以抑制細(xì)胞的生長,槐定堿和順鉑聯(lián)合處理表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞生長抑制性能。集落形成測定表明,槐定堿或順鉑的單一處理抑制了細(xì)胞集落的發(fā)展,并且兩種試劑的組合顯著減少了克隆形成(*p值0.05,**p值0.01)。2、槐定堿在體外抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。將細(xì)胞接種到涂有Matrigel的膜上(用于侵襲測定)或transwell室(用于遷移測定)并用槐定堿、順鉑或槐定堿同順鉑處理24小時,結(jié)果表明,槐定堿抑制了這四種肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。并且用順鉑(1μM)或順鉑與槐定堿聯(lián)合處理細(xì)胞后,結(jié)果表明,順鉑和槐定堿共同處理組可有效抑制細(xì)胞的侵襲和遷移,進(jìn)一步證實槐定堿與順鉑在治療肺癌上具有協(xié)同功效。(*p值0.05,**p值0.01)。3、我們還通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)測試了p53信號通路中關(guān)鍵分子MDM2,Puma,P21和p53的表達(dá)水平,結(jié)果表明MDM2,Puma,P21和p53的這些蛋白在NCI-H460和A549細(xì)胞系中都上調(diào)了,但在p53缺陷型NCI-H1299細(xì)胞系中并沒有出現(xiàn)這種情況。并且我們通過半衰期實驗監(jiān)測NCI-H460細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平,結(jié)果表明,槐定堿大大延長了P53的半衰期,槐定堿穩(wěn)定了內(nèi)源性P53蛋白。然后我們經(jīng)行了體外泛素化實驗,結(jié)果表明槐定堿通過減少M(fèi)DM2介導(dǎo)的P53蛋白泛素化以及穩(wěn)定P53蛋白,激活p53信號通路,最終起腫瘤抑制劑的作用。4、我們通過蛋白質(zhì)印跡研究了槐定堿對Hippo途徑核心組分蛋白質(zhì)的影響。結(jié)果表明,槐定堿增加了NAP-H460和A549細(xì)胞中Hippo通路主要的蛋白LATS1/2,MST1/2,P-YAP的表達(dá),同時降低了YAP的表達(dá)。通過槐定堿處理,上述細(xì)胞系中CTGF蛋白水平下調(diào)了,這是Hippo途徑激活的結(jié)果。然而,對于p53缺陷的NCI-H1299細(xì)胞系,槐定堿對Hippo途徑組分的表達(dá)沒有影響。我們還通過定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測定NCI-H460細(xì)胞中一些Hippo途徑的mRNA水平及靶基因水平,結(jié)果顯示,用槐定堿處理后,NCI-H460細(xì)胞中CYR61,CDX2,FOXM1,c-myc和VEGF減少。這些發(fā)現(xiàn)表明槐定堿可能激活肺癌細(xì)胞中的Hippo通路。5、我們通過建立異種移植模型成瘤實驗,將荷瘤小鼠隨機(jī)分為槐定堿組,順鉑組,槐定堿+順鉑組和陰性對照組并定期按分組不同加入相應(yīng)組別的藥物,結(jié)果表明,槐定堿+順鉑共處理組比槐定堿或順鉑單一處理組更顯著地減緩異種移植腫瘤的生長。與腫瘤生長曲線一致的是,槐定堿+順鉑聯(lián)合治療組腫瘤質(zhì)量和體重的減少比槐定堿或順鉑單一治療組更顯著。并且我們使用異種移植腫瘤經(jīng)行了WB及IHC實驗,結(jié)果示,槐定堿處理的腫瘤中P53,MDM2,LATS1,LATS2的蛋白質(zhì)水平升高,而YAP和CTGF降低。結(jié)論:1、槐定堿不僅可以阻止肺癌細(xì)胞的增殖,還可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。2、槐定堿抑制肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移的相關(guān)過程(侵襲和遷移),并在此實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實槐定堿與順鉑在治療肺癌具有協(xié)同功效。3、槐定堿通過減少M(fèi)DM2介導(dǎo)的P53泛素化過程以穩(wěn)定P53蛋白,激活p53信號通路而起到腫瘤抑制劑的作用。4、槐定堿可能激活肺癌細(xì)胞中的Hippo通路。
【圖文】：

圖 1：槐定堿協(xié)同順鉑對體外細(xì)胞增殖的影響在 NCI-H460，NCI-H1299，A549 和 DMS153 細(xì)胞中進(jìn)行 CCK-8 和集落形成測定。（a）在 12h，24h，48h，72h 和 96h，用槐定堿（20μg/ ml）、順鉑（6μM）和槐定堿（20μg/ ml）+順鉑（6μM）處理后，，經(jīng)細(xì)胞的 CCK-8 測

圖 2：槐定堿協(xié)同順鉑對體外細(xì)胞侵襲和遷移的影響在 NCI-H460，NCI-H1299，NCI-H446 和 DMS153 細(xì)胞中進(jìn)行 Transwell侵襲和遷移測定。將細(xì)胞接種到涂有Matrigel的膜上（用于侵襲測定）或transwell室（用于遷移測定）并用槐定堿（120μg/ ml），順鉑（10μM）和槐定堿（120
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2692168