【摘要】：背景與目的:肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。有兩種主要的組織學(xué)肺癌:非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。NSCLC占病例的80%以上,而SCLC的特征是細(xì)胞快速生長(zhǎng)和侵襲性轉(zhuǎn)移�；阢K的化療是肺癌的重要治療選擇。然而,由于耐藥性的發(fā)展和相當(dāng)大的不良反應(yīng),化療的治療效果受到限制。因此,有必要尋找新的策略,盡量減少鉑類(lèi)化療的上述兩個(gè)主要缺點(diǎn),以逆轉(zhuǎn)肺癌對(duì)化療藥物的耐藥性�；倍▔A是一種從苦豆子中提取的喹嗪類(lèi)生物堿。它具有一系列藥理特性,如抗病毒,抗炎,改善心臟功能和抗癌。2005年,中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)批準(zhǔn)槐定堿注射液治療惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。最近,越來(lái)越多的報(bào)道表明槐定堿在許多其他惡性腫瘤中也具有抑制作用。然而,很少有報(bào)道研究槐定堿在肺癌中的腫瘤抑制作用及其在臨床肺癌治療中的作用。在本研究中,實(shí)驗(yàn)組主要目的是探討槐定堿的抗腫瘤作用、槐定堿能否提高順鉑的抗腫瘤功效以及槐定堿與順鉑是否對(duì)肺癌的治療具有協(xié)同作用。最終證明槐定堿和鉑類(lèi)化療的聯(lián)合治療是一種很有前景的肺癌治療方法。材料與方法:細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)用了五株肺癌細(xì)胞系,NCI-H460,NCI-H1299,A549,NCI-H446和DMS153,將所有細(xì)胞系在37℃及含有5%二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中溫育。細(xì)胞活力測(cè)試使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)以及Microplate Reader(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)在450nm紫外線吸收峰下測(cè)量實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度。集落形成實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)每個(gè)平板的菌落數(shù)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在Transwell小室中的侵襲遷移能力。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了P53及HIPPO細(xì)胞信號(hào)通路的核心蛋白組份。此外還運(yùn)用熒光定量PCR測(cè)定了HIPPO細(xì)胞信號(hào)通路的下游靶基因表達(dá)情況。并且運(yùn)用裸鼠的異種移植實(shí)驗(yàn)將處理后的肺癌細(xì)胞定植于裸鼠腹膜內(nèi),觀察瘤體的大小及做進(jìn)一步免疫組化和免疫印跡實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果:1、槐定堿在體外抑制肺癌細(xì)胞的增殖。通過(guò)CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn),測(cè)定分析槐定堿對(duì)不同類(lèi)型的人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響。首先,CCK8實(shí)驗(yàn)表明,槐定堿或順鉑單一處理組足以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),槐定堿和順鉑聯(lián)合處理表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性能。集落形成測(cè)定表明,槐定堿或順鉑的單一處理抑制了細(xì)胞集落的發(fā)展,并且兩種試劑的組合顯著減少了克隆形成(*p值0.05,**p值0.01)。2、槐定堿在體外抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。將細(xì)胞接種到涂有Matrigel的膜上(用于侵襲測(cè)定)或transwell室(用于遷移測(cè)定)并用槐定堿、順鉑或槐定堿同順鉑處理24小時(shí),結(jié)果表明,槐定堿抑制了這四種肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。并且用順鉑(1μM)或順鉑與槐定堿聯(lián)合處理細(xì)胞后,結(jié)果表明,順鉑和槐定堿共同處理組可有效抑制細(xì)胞的侵襲和遷移,進(jìn)一步證實(shí)槐定堿與順鉑在治療肺癌上具有協(xié)同功效。(*p值0.05,**p值0.01)。3、我們還通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)測(cè)試了p53信號(hào)通路中關(guān)鍵分子MDM2,Puma,P21和p53的表達(dá)水平,結(jié)果表明MDM2,Puma,P21和p53的這些蛋白在NCI-H460和A549細(xì)胞系中都上調(diào)了,但在p53缺陷型NCI-H1299細(xì)胞系中并沒(méi)有出現(xiàn)這種情況。并且我們通過(guò)半衰期實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)NCI-H460細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平,結(jié)果表明,槐定堿大大延長(zhǎng)了P53的半衰期,槐定堿穩(wěn)定了內(nèi)源性P53蛋白。然后我們經(jīng)行了體外泛素化實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明槐定堿通過(guò)減少M(fèi)DM2介導(dǎo)的P53蛋白泛素化以及穩(wěn)定P53蛋白,激活p53信號(hào)通路,最終起腫瘤抑制劑的作用。4、我們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡研究了槐定堿對(duì)Hippo途徑核心組分蛋白質(zhì)的影響。結(jié)果表明,槐定堿增加了NAP-H460和A549細(xì)胞中Hippo通路主要的蛋白LATS1/2,MST1/2,P-YAP的表達(dá),同時(shí)降低了YAP的表達(dá)。通過(guò)槐定堿處理,上述細(xì)胞系中CTGF蛋白水平下調(diào)了,這是Hippo途徑激活的結(jié)果。然而,對(duì)于p53缺陷的NCI-H1299細(xì)胞系,槐定堿對(duì)Hippo途徑組分的表達(dá)沒(méi)有影響。我們還通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測(cè)定NCI-H460細(xì)胞中一些Hippo途徑的mRNA水平及靶基因水平,結(jié)果顯示,用槐定堿處理后,NCI-H460細(xì)胞中CYR61,CDX2,FOXM1,c-myc和VEGF減少。這些發(fā)現(xiàn)表明槐定堿可能激活肺癌細(xì)胞中的Hippo通路。5、我們通過(guò)建立異種移植模型成瘤實(shí)驗(yàn),將荷瘤小鼠隨機(jī)分為槐定堿組,順鉑組,槐定堿+順鉑組和陰性對(duì)照組并定期按分組不同加入相應(yīng)組別的藥物,結(jié)果表明,槐定堿+順鉑共處理組比槐定堿或順鉑單一處理組更顯著地減緩異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。與腫瘤生長(zhǎng)曲線一致的是,槐定堿+順鉑聯(lián)合治療組腫瘤質(zhì)量和體重的減少比槐定堿或順鉑單一治療組更顯著。并且我們使用異種移植腫瘤經(jīng)行了WB及IHC實(shí)驗(yàn),結(jié)果示,槐定堿處理的腫瘤中P53,MDM2,LATS1,LATS2的蛋白質(zhì)水平升高,而YAP和CTGF降低。結(jié)論:1、槐定堿不僅可以阻止肺癌細(xì)胞的增殖,還可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。2、槐定堿抑制肺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移的相關(guān)過(guò)程(侵襲和遷移),并在此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)槐定堿與順鉑在治療肺癌具有協(xié)同功效。3、槐定堿通過(guò)減少M(fèi)DM2介導(dǎo)的P53泛素化過(guò)程以穩(wěn)定P53蛋白,激活p53信號(hào)通路而起到腫瘤抑制劑的作用。4、槐定堿可能激活肺癌細(xì)胞中的Hippo通路。
【圖文】：

圖 1：槐定堿協(xié)同順鉑對(duì)體外細(xì)胞增殖的影響在 NCI-H460，NCI-H1299，A549 和 DMS153 細(xì)胞中進(jìn)行 CCK-8 和集落形成測(cè)定。（a）在 12h，24h，48h，72h 和 96h，用槐定堿（20μg/ ml）、順鉑（6μM）和槐定堿（20μg/ ml）+順鉑（6μM）處理后，，經(jīng)細(xì)胞的 CCK-8 測(cè)

圖 2：槐定堿協(xié)同順鉑對(duì)體外細(xì)胞侵襲和遷移的影響在 NCI-H460，NCI-H1299，NCI-H446 和 DMS153 細(xì)胞中進(jìn)行 Transwell侵襲和遷移測(cè)定。將細(xì)胞接種到涂有Matrigel的膜上（用于侵襲測(cè)定）或transwell室（用于遷移測(cè)定）并用槐定堿（120μg/ ml），順鉑（10μM）和槐定堿（120
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李明潺;王玉麗;董林易;;槐定堿對(duì)肺癌A549細(xì)胞體外增殖和侵襲抑制作用及機(jī)制的研究[J];中國(guó)藥學(xué)雜志;2015年13期

2 鄧皖利;朱蕾;呂書(shū)勤;陸明;;苦豆子提取物對(duì)裸鼠腸癌移植瘤抑制作用以及對(duì)受體酪氨酸激酶(EphA1)表達(dá)的影響[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2014年02期

3 嚴(yán)繼貴;楊宇清;王雅潔;闞晶;;槐定堿抗骨癌痛作用及其機(jī)制研究[J];中國(guó)中藥雜志;2013年23期

4 高鵬;鐘俊;王國(guó)成;;槐定堿結(jié)構(gòu)改造及其抗腫瘤活性[J];天津藥學(xué);2013年04期

5 鄧皖利;呂書(shū)勤;王巧琳;林燕;段春燕;陸明;;槐定堿調(diào)控B7-H1基因逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞多藥耐藥的研究[J];新中醫(yī);2013年01期

6 韓靚;鄧皖利;呂書(shū)勤;張洪平;陸明;;槐定堿抑制人胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J];湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2012年02期

7 田真真;萬(wàn)紅嬌;楊翠萍;;槐定堿的藥理研究綜述[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2010年11期

8 張亮;范衛(wèi)君;范新華;唐田;;鹽酸槐定堿注射液聯(lián)合超液化碘油在胃腸道腫瘤肝轉(zhuǎn)移化療栓塞中的初步應(yīng)用研究[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué)(中國(guó)介入放射學(xué));2008年03期

9 梁磊;張緒慧;王曉燕;陳艷;鄧虹珠;;槐定堿對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株SW620增殖和凋亡的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2008年06期

10 姚婉霞;周俊俊;閆琳;金少舉;蔣袁絮;;氧化槐定堿鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制研究[J];中草藥;2008年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 馬小萍;槐定堿聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸腺癌Hela細(xì)胞增殖抑制作用的研究[D];蘭州大學(xué);2014年

2 馬嵐;槐定堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用及其基因調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2692168