【摘要】：背景非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已經(jīng)成為全球主要的肝臟疾病和重要的公共衛(wèi)生問題之一。NAFLD疾病譜廣,包括單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、NASH相關(guān)肝纖維化、肝硬化及肝細胞癌等系列病理改變。NAFLD的病因和發(fā)病機理還有爭議,既往的“兩次打擊學(xué)說(two-hit model)”被認為是解釋NAFLD發(fā)病機制的經(jīng)典學(xué)說,但近年來更傾向于“多重平行打擊學(xué)說(multiple parallel hits model),該學(xué)說在解釋NAFLD發(fā)病機制方面占主導(dǎo)地位,認為腸道菌群紊亂及其導(dǎo)致的腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia,IETM)是導(dǎo)致肝臟持續(xù)性炎性損傷及NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵“打擊”環(huán)節(jié)�！澳c-肝”軸失衡(包括腸道菌群紊亂、腸源性內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)過度產(chǎn)生、腸黏膜屏障通透性改變等)是NAFLD進程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在高脂膳食誘導(dǎo)下,機體腸道菌群紊亂,腸腔內(nèi)革蘭氏陰性菌過度生長并產(chǎn)生大量LPS,伴隨腸道通透性增加,LPS可以通過損傷的腸道屏障進入血液循環(huán),直至肝臟和機體全身,從而誘導(dǎo)肝臟炎癥(如激活LPS-TLR4下游通路)及損傷。隨著對“腸-肝”軸認識的不斷深入,腸黏膜屏障功能在預(yù)防NAFLD發(fā)生中的作用被高度關(guān)注。腸黏膜屏障能夠防止腸源性致病因子侵入和阻止腸道內(nèi)細菌及內(nèi)毒素的易位,被稱為抵御腸源性致病因子的“第一道防線”。近年來研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system,ECS)與NAFLD發(fā)生密切相關(guān),在介導(dǎo)腸黏膜屏障功能、調(diào)節(jié)腸黏膜通透性和IETM中起關(guān)鍵作用。ECS主要包括內(nèi)源性大麻素受體(如CB1與CB2)、內(nèi)源性大麻素樣配體及其合成與降解的分子機制,其功能與調(diào)節(jié)機制復(fù)雜,可調(diào)節(jié)能量代謝、胃腸道功能、免疫系統(tǒng)反應(yīng)、肝臟代謝等涉及多個器官系統(tǒng)。同時ECS與腸道菌群關(guān)系密切,有研究發(fā)現(xiàn)給予高脂誘導(dǎo)的小鼠腸道特殊菌群干預(yù)(例如Akkermansia muciniphila),可直接調(diào)控腸道ECS的活性,并改善腸黏膜屏障功能,減少IETM發(fā)生�！澳c道菌群-ECS”在維持腸黏膜屏障功能預(yù)防NAFLD發(fā)生中發(fā)揮十分重要的作用。NAFLD發(fā)生發(fā)展受到多因素影響,包括腸道菌群、基因遺傳差異以及膳食干預(yù)等多因素。SIRT3是生物體線粒體功能必備的調(diào)節(jié)器,在慢性代謝性疾病中作用顯著,例如NAFLD,糖尿病和胰島素抵抗等。在人群中,SIRT3基因rs11246020變異與NAFLD發(fā)生風(fēng)險相關(guān),更易感于發(fā)生肝臟脂質(zhì)變性及肝臟炎癥,其表現(xiàn)為SIRT3的低酶活性。SIRT3敲除(SIRT3 knockout,SIRT3KO)小鼠與野生型129品系小鼠相比,經(jīng)高脂喂養(yǎng)更快速造模,并更易出現(xiàn)程度嚴(yán)重的肝臟脂質(zhì)蓄積,肝纖維化及炎癥。綜上所述,SIRT3基因敲除小鼠可作為研究非酒精性脂肪肝發(fā)病機制的良好模型,在高脂膳食下表現(xiàn)明顯的肝臟脂肪變性及炎癥。白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)是重要的天然多酚類化合物,主要食物來源有葡萄、花生和一些漿果類水果。近年來研究表明白藜蘆醇具有抗NAFLD、改善脂代謝和胰島素敏感性等生物學(xué)效應(yīng)。因此,白藜蘆醇可能成為防控NAFLD的理想植物化合物。然而,白藜蘆醇在體內(nèi)生物利用率極低、代謝和清除速率很快、且其血清有效濃度只有痕量水平。白藜蘆醇的高生物學(xué)效應(yīng)及其低生物利用率之間存在明顯矛盾。近年研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群可通過調(diào)控能量代謝和腸道功能來調(diào)控ECS。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可改善高脂誘導(dǎo)的大鼠腸道菌群組成,并調(diào)節(jié)結(jié)腸CB1和CB2表達水平。基于上述研究背景,本研究提出如下科學(xué)假說:白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)“腸道菌群-ECS”改善腸黏膜屏障功能預(yù)防HFD誘導(dǎo)的NAFLD發(fā)生。該課題首次報道白藜蘆醇可通過“腸道菌群-ECS”維持腸道屏障功能從而改善NAFLD有益作用,將為預(yù)防NAFLD提供新的膳食營養(yǎng)干預(yù)策略,并為研究防控NAFLD新型藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。目的研究腸道菌群、ECS和SIRT3基因在高脂誘導(dǎo)的NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)性機制,并進一步闡明白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)“腸道菌群-ECS”改善腸黏膜屏障功能預(yù)防HFD誘導(dǎo)的NAFLD發(fā)生發(fā)展的作用機制,為防控NAFLD新型藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法(1)高脂飼料喂養(yǎng)雄性SIRT3基因敲除小鼠及野生型(WT)129系小鼠18周建立NAFLD模型。觀察小鼠體重及肝指數(shù)變化,比較各組小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積、肝臟炎性浸潤、病理學(xué)改變及血清學(xué)指標(biāo),比較肝臟葡萄糖代謝及脂質(zhì)生成相關(guān)基因表達水平。檢測小鼠腸道屏障通透性、腸道炎癥狀態(tài)及腸源性內(nèi)毒素血癥水平。檢測結(jié)腸及肝臟組織中ECS受體CB1及CB2表達水平。通過16S rRNA基因測序、PCoA分析以及PICRUSt分析腸道菌群組成和功能差異,使用相關(guān)性heatmap圖及RDA分析腸道菌群及各生理生化指標(biāo)的相關(guān)性,重點分析腸道菌群、ECS和SIRT3在高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠NAFLD發(fā)生中的相關(guān)性。(2)高脂飼料喂養(yǎng)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠6周建立NAFLD模型。白藜蘆醇(RSV)灌胃。廣譜抗生素(Abx)干預(yù)實驗在高脂干預(yù)6周造模后,Abx加于飲水中干預(yù)4周。ECS抑制劑/激動劑干預(yù)實驗在高脂干預(yù)6周造模后,分別采用CB1激動劑ACEA、CB2抑制劑AM630和溶劑對照組vehicle腹腔注射干預(yù)4周。觀察RSV對大鼠體重及肝指數(shù)變化,比較各組大鼠肝臟脂質(zhì)蓄積、肝臟炎性浸潤、病理學(xué)改變及血清學(xué)指標(biāo)。檢測大鼠細菌易位、腸道屏障完整性、腸道屏障通透性、腸道炎癥狀態(tài)及腸源性內(nèi)毒素血癥水平。檢測結(jié)腸中CB1、CB2以及ECS相關(guān)配體合成降解酶表達水平。通過16S rRNA基因測序、PCA分析、LEfSe分析以及PICRUSt分析腸道菌群組成及功能,使用相關(guān)性heatmap圖及RDA分析腸道菌群及各生理生化指標(biāo)的相關(guān)性。通過抗生素干預(yù)實驗檢測腸道菌群和ECS在RSV改善高脂誘導(dǎo)NAFLD發(fā)生發(fā)展中的作用,通過ECS抑制劑/激動劑干預(yù)實驗闡明CB1和CB2分別在RSV改善腸道屏障和減輕腸道炎癥中的作用。進一步分析“腸道菌群-ECS”在白藜蘆醇調(diào)節(jié)腸道屏障功能、改善高脂誘導(dǎo)的大鼠NAFLD發(fā)生中的作用。結(jié)果(1)腸道菌群、ECS和SIRT3在高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展中起重要作用,高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)、腸道菌群紊亂和腸道屏障功能下降、CB1表達增加等變化在SIRT3缺失情況下更加顯著,提示腸道菌群、ECS可能成為防控NAFLD的重要干預(yù)靶點。(1)高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致WT小鼠和SIRT3KO小鼠肝臟脂肪變性及肝臟炎癥顯著增加,肝臟及血漿中TG和T-CHO水平、血漿ALT和AST活性、血漿TNF-α和IL-6含量顯著上升,胰島素抵抗明顯增加,肝臟葡萄糖代謝及脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達水平明顯提高。高脂組小鼠出現(xiàn)明顯腸道屏障破損及腸道炎癥發(fā)生。高脂組小鼠腸道菌群紊亂,其中脫硫弧菌(Desulfovibrio)、腸道通透性及黏膜完整性相關(guān)的Oscillibacter和Mucispirillum相對豐度顯著性升高,短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌Alloprevotella、Lachnospiraceae_NK4A136_group相對豐度顯著降低。同時,高脂喂養(yǎng)小鼠血漿及肝臟LPS水平顯著上升,結(jié)腸及肝臟中CB1表達水平顯著增加。上述NAFLD表型、腸道菌群紊亂及腸源性內(nèi)毒素血癥在SIRT3KO小鼠中更為顯著。(2)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Desulfovibrio的豐度與血漿LPS濃度,肝臟TG含量以及結(jié)腸CB1的mRNA表達量之間呈正相關(guān);產(chǎn)短鏈脂肪酸的Lachnospiraceae科與結(jié)腸ZO-1及occludin的mRNA表達水平之間呈正相關(guān)。(2)“腸道菌群-ECS”在白藜蘆醇調(diào)節(jié)腸道屏障功能、改善高脂誘導(dǎo)的大鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用,白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)減少腸內(nèi)LPS產(chǎn)生,同時抑制結(jié)腸CB1減少腸道通透性及活化CB2減輕腸道炎癥,最終減少腸源性LPS導(dǎo)致的肝臟脂肪變性和炎性損傷,延緩NAFLD發(fā)生發(fā)展。(1)高脂誘導(dǎo)的大鼠NAFLD模型中發(fā)現(xiàn),大鼠體重、肝指數(shù)、肝臟脂肪變性及炎癥表型顯著增加,大鼠腸道屏障破損、腸道炎癥顯著,上述癥狀可被RSV逆轉(zhuǎn)。RSV可減輕高脂干預(yù)大鼠的腸源性內(nèi)毒素血癥(血漿LPS)、減少細菌易位及增加腸道緊密連接蛋白(occludin、ZO1和claudin1)的表達,減輕腸道炎癥癥狀(顯著降低TNF-α、IL-1β和IL-6,增加IL-10表達),降低末端結(jié)腸LPS下游通路FAK/MyD88/IRAK4的表達。同時RSV可重塑腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂狀態(tài),通過增加Akkermansia muciniphila,短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌Ruminococcaceae,和Lachnospiraceae相對豐度,并且降低LPS產(chǎn)生菌Desulfovibrio的相對豐度來實現(xiàn)。(2)通過抗生素干預(yù)實驗消除腸道中大部分腸道菌群后,發(fā)現(xiàn)RSV對大鼠NAFLD的保護作用被削弱�？股馗深A(yù)后,RSV對大鼠體重、血漿TG和T-CHO水平、腸道通透性、血漿LPS水平以及腸道炎癥水平(增加TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平,降低IL-10表達水平)的抑制作用被削弱;同時RSV對大鼠結(jié)腸CB1和CB2表達的調(diào)節(jié)作用(升高CB1和降低CB2表達水平)被明顯抑制。(3)通過ECS抑制劑/激動劑干預(yù)實驗發(fā)現(xiàn),RSV可逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸CB1活性增加和CB2活性降低,RSV增強腸道屏障完整性及降低腸道通透性的作用可被CB1激動劑ACEA阻斷,而RSV抑制腸道炎癥的效應(yīng)可被CB2抑制劑AM630消除。(4)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)脫硫弧菌(Desulfovibrio)的豐度分別與血漿LPS濃度,腸道通透性以及結(jié)腸CB1的mRNA表達量之間呈正相關(guān)。產(chǎn)短鏈脂肪酸菌Lachnospiraceae_UCG_010、Ruminococcaceae_UCG_014、Akkermansia Muciniphila與盲腸內(nèi)丁酸含量,結(jié)腸ZO1、Occludin、CB2的mRNA表達水平之間呈正相關(guān)。結(jié)論腸道菌群、ECS和SIRT3在高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展中起重要作用,高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)、腸道菌群紊亂和腸道屏障功能下降、CB1表達增加在SIRT3缺失情況下更加顯著,提示腸道菌群、ECS可能成為防控NAFLD的重要干預(yù)靶點。“腸道菌群-ECS”在白藜蘆醇調(diào)節(jié)腸道屏障功能、改善高脂誘導(dǎo)的大鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用,RSV通過調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)減少腸道LPS產(chǎn)生,同時抑制結(jié)腸CB1減少腸道通透性及活化CB2減輕腸道炎癥,最終減少腸源性LPS導(dǎo)致的肝臟脂肪變性和炎性損傷,延緩NAFLD發(fā)生發(fā)展。本研究將為預(yù)防NAFLD提供新的膳食營養(yǎng)干預(yù)策略,并為研究防控NAFLD新型藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2692067