【摘要】：甘草是我國(guó)最常用的大宗藥材之一,素有“十方九草”之譽(yù)。近些年來(lái),栽培甘草普遍存在品質(zhì)退化和有效成分含量低等問(wèn)題,已成為制約甘草資源可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。大量文獻(xiàn)報(bào)道顯示:毛狀根可穩(wěn)定高效的生產(chǎn)藥用植物的次生代謝產(chǎn)物,因此利用毛狀根培養(yǎng)體系對(duì)甘草的次生代謝途徑開(kāi)展研究具有重要價(jià)值。甘草苷是甘草中最重要的活性成分之一,查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)及查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)是甘草苷生物合成途徑中起關(guān)鍵調(diào)控作用的限速酶。因此,本論文擬在前期克隆獲得甘草CHS及CHI基因的基礎(chǔ)上,構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體及發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌,利用毛狀根培養(yǎng)體系對(duì)甘草CHS及CHI基因進(jìn)行功能研究,揭示其影響黃酮類化合物生物合成的分子機(jī)制。本課題的研究結(jié)果還將進(jìn)一步篩選甘草苷高水平積累的毛狀根體系,為甘草苷的離體合成奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)支持。本文根據(jù)課題組前期對(duì)于甘草黃酮類化合物含量與CHS、CHI基因多態(tài)性相關(guān)關(guān)系的分析結(jié)果篩選出黃酮高含量對(duì)應(yīng)的特異CHS、CHI基因單倍型;采用基因融合的方法構(gòu)建甘草轉(zhuǎn)CHS、CHI基因植物雙元表達(dá)載體;通過(guò)電轉(zhuǎn)法將甘草轉(zhuǎn)CHS、CHI基因植物雙元表達(dá)載體導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌;用轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌侵染甘草外植體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根,并進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證;建立同時(shí)測(cè)定甘草毛狀根中四種黃酮成分含量的UPLC方法,并對(duì)培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)CHS、CHI基因甘草毛狀根進(jìn)行含量測(cè)定;通過(guò)qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)CHS、CHI基因毛狀根中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定,分析目標(biāo)基因拷貝數(shù)與毛狀根中黃酮類化合物含量的相關(guān)性。本論文共取得了如下研究結(jié)果:(1)根據(jù)黃酮類化合物含量與CHS、CHI基因多態(tài)性相關(guān)關(guān)系的分析結(jié)果,篩選出黃酮類化合物高含量甘草樣品對(duì)應(yīng)的特異CHI-1(GenBank注冊(cè)號(hào):KY115232),CHS-60(GenBank注冊(cè)號(hào):KY810356)單倍型。(2)選擇Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ作為酶切位點(diǎn),pCAMBIA1305.1為植物雙元表達(dá)載體,采用基因融合的方法,成功構(gòu)建甘草轉(zhuǎn)CHI、CHS基因植物雙元表達(dá)載體pCA-CHI、pCA-CHS。(3)采用電轉(zhuǎn)法(電轉(zhuǎn)條件:C:25μF;PC:200Ω;U:2400V)分別將攜帶有甘草CHI和CHS基因的雙元表達(dá)載體pCA-CHI和pCA-CHS導(dǎo)入到發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060中,構(gòu)建得到轉(zhuǎn)甘草CHI、CHS的發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌。(4)利用轉(zhuǎn)CHI、CHS基因發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌侵染甘草外植體胚軸及子葉,通過(guò)PCR驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證,成功獲得了轉(zhuǎn)CHI、CHS基因甘草毛狀根。(5)建立了同時(shí)測(cè)定甘草毛狀根中4種主要黃酮類化合物含量的UPLC方法,并采用此方法對(duì)54份甘草毛狀根樣品中的黃酮類化合物進(jìn)行含量測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,黃酮總含量在轉(zhuǎn)CHI基因甘草毛狀根和空白甘草毛狀根樣品、轉(zhuǎn)CHS基因甘草毛狀根和空白甘草毛狀根樣品中均存在顯著性差異,通過(guò)比較秩均數(shù),黃酮含量滿足:轉(zhuǎn)CHI基因甘草毛狀根轉(zhuǎn)CHS基因甘草毛狀根空白甘草毛狀根,從而證實(shí)過(guò)表達(dá)CHS、CHI基因能夠增加甘草毛狀根中黃酮類成分的含量。(6)利用qRT-PCR對(duì)15份轉(zhuǎn)CHI基因和轉(zhuǎn)CHS基因毛狀根中目標(biāo)基因拷貝數(shù)進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示8份過(guò)表達(dá)CHI基因甘草毛狀根中CHI基因拷貝數(shù)分別為1、2或5個(gè),7份過(guò)表達(dá)CHS基因毛狀根中CHS基因拷貝數(shù)分別為7、9、10、11、13或18個(gè)。(7)根據(jù)目標(biāo)基因拷貝數(shù)及黃酮類化合物含量測(cè)定結(jié)果,最終優(yōu)選出拷貝數(shù)為9的轉(zhuǎn)CHS基因甘草毛狀根以及拷貝數(shù)為5的轉(zhuǎn)CHI基因甘草毛狀根作為進(jìn)一步離體積累黃酮類化合物的甘草毛狀根材料,為將來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R282.71

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本文編號(hào)：2691773