【摘要】：甘草是我國最常用的大宗藥材之一,素有“十方九草”之譽。近些年來,栽培甘草普遍存在品質(zhì)退化和有效成分含量低等問題,已成為制約甘草資源可持續(xù)發(fā)展的關鍵問題。大量文獻報道顯示:毛狀根可穩(wěn)定高效的生產(chǎn)藥用植物的次生代謝產(chǎn)物,因此利用毛狀根培養(yǎng)體系對甘草的次生代謝途徑開展研究具有重要價值。甘草苷是甘草中最重要的活性成分之一,查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)及查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)是甘草苷生物合成途徑中起關鍵調(diào)控作用的限速酶。因此,本論文擬在前期克隆獲得甘草CHS及CHI基因的基礎上,構(gòu)建植物雙元表達載體及發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌,利用毛狀根培養(yǎng)體系對甘草CHS及CHI基因進行功能研究,揭示其影響黃酮類化合物生物合成的分子機制。本課題的研究結(jié)果還將進一步篩選甘草苷高水平積累的毛狀根體系,為甘草苷的離體合成奠定理論基礎和提供技術支持。本文根據(jù)課題組前期對于甘草黃酮類化合物含量與CHS、CHI基因多態(tài)性相關關系的分析結(jié)果篩選出黃酮高含量對應的特異CHS、CHI基因單倍型;采用基因融合的方法構(gòu)建甘草轉(zhuǎn)CHS、CHI基因植物雙元表達載體;通過電轉(zhuǎn)法將甘草轉(zhuǎn)CHS、CHI基因植物雙元表達載體導入發(fā)根農(nóng)桿菌;用轉(zhuǎn)基因發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌侵染甘草外植體誘導轉(zhuǎn)基因毛狀根,并進行PCR和測序驗證;建立同時測定甘草毛狀根中四種黃酮成分含量的UPLC方法,并對培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)CHS、CHI基因甘草毛狀根進行含量測定;通過qRT-PCR對轉(zhuǎn)CHS、CHI基因毛狀根中目標基因的拷貝數(shù)進行測定,分析目標基因拷貝數(shù)與毛狀根中黃酮類化合物含量的相關性。本論文共取得了如下研究結(jié)果:(1)根據(jù)黃酮類化合物含量與CHS、CHI基因多態(tài)性相關關系的分析結(jié)果,篩選出黃酮類化合物高含量甘草樣品對應的特異CHI-1(GenBank注冊號:KY115232),CHS-60(GenBank注冊號:KY810356)單倍型。(2)選擇Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ作為酶切位點,pCAMBIA1305.1為植物雙元表達載體,采用基因融合的方法,成功構(gòu)建甘草轉(zhuǎn)CHI、CHS基因植物雙元表達載體pCA-CHI、pCA-CHS。(3)采用電轉(zhuǎn)法(電轉(zhuǎn)條件:C:25μF;PC:200Ω;U:2400V)分別將攜帶有甘草CHI和CHS基因的雙元表達載體pCA-CHI和pCA-CHS導入到發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060中,構(gòu)建得到轉(zhuǎn)甘草CHI、CHS的發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌。(4)利用轉(zhuǎn)CHI、CHS基因發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌侵染甘草外植體胚軸及子葉,通過PCR驗證及測序驗證,成功獲得了轉(zhuǎn)CHI、CHS基因甘草毛狀根。(5)建立了同時測定甘草毛狀根中4種主要黃酮類化合物含量的UPLC方法,并采用此方法對54份甘草毛狀根樣品中的黃酮類化合物進行含量測定。統(tǒng)計學分析表明,黃酮總含量在轉(zhuǎn)CHI基因甘草毛狀根和空白甘草毛狀根樣品、轉(zhuǎn)CHS基因甘草毛狀根和空白甘草毛狀根樣品中均存在顯著性差異,通過比較秩均數(shù),黃酮含量滿足:轉(zhuǎn)CHI基因甘草毛狀根轉(zhuǎn)CHS基因甘草毛狀根空白甘草毛狀根,從而證實過表達CHS、CHI基因能夠增加甘草毛狀根中黃酮類成分的含量。(6)利用qRT-PCR對15份轉(zhuǎn)CHI基因和轉(zhuǎn)CHS基因毛狀根中目標基因拷貝數(shù)進行了測定,結(jié)果顯示8份過表達CHI基因甘草毛狀根中CHI基因拷貝數(shù)分別為1、2或5個,7份過表達CHS基因毛狀根中CHS基因拷貝數(shù)分別為7、9、10、11、13或18個。(7)根據(jù)目標基因拷貝數(shù)及黃酮類化合物含量測定結(jié)果,最終優(yōu)選出拷貝數(shù)為9的轉(zhuǎn)CHS基因甘草毛狀根以及拷貝數(shù)為5的轉(zhuǎn)CHI基因甘草毛狀根作為進一步離體積累黃酮類化合物的甘草毛狀根材料,為將來擴大培養(yǎng)奠定基礎。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R282.71

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